一种用于鉴别强、弱鸭瘟毒株的引物、试剂盒及其鉴别方法技术

本发明专利技术公开了一种用于鉴别强、弱鸭瘟毒株的引物、试剂盒及其鉴别方法。本发明专利技术将X片段与弱毒株C

【技术实现步骤摘要】
一种用于鉴别强、弱鸭瘟毒株的引物、试剂盒及其鉴别方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于鉴别强、弱鸭瘟毒株的引物、试剂盒及其鉴别方法。

技术介绍

[0002]鸭瘟(Duck plague,DP)，又称鸭病毒性肠炎(Duck viral enteritis,DVE)，是由鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)引起的一种急性、热性、败血性传染病。DPV感染后病鸭临床表现为体温升至43℃以上，眼睑出现水肿和粘连、鼻中流出分泌物、下痢并排出灰白色稀粪，部分病鸭头部肿胀，故又称“大头瘟”。急性败血症是病鸭剖解的主要特征，病鸭的皮肤、黏膜、浆膜及内脏器官出现不同程度的出血；食道黏膜覆有灰黄色假膜，并出现少量出血点。食道膨大部、腺胃交界处和十二指肠处常出现出血带，十二指肠和直肠处的充血较为严重。病鸭的组织病理学观察也显示淋巴器官、消化器官严重病变，出现中枢免疫器官淋巴细胞数量降低，肠黏膜上皮细胞肿胀脱落，肠道固有层结缔组织增生等。自1923年荷兰报道鸭瘟以来，在世界各地养鸭业中均有发现，黄引贤于1957年首次报道我国发现鸭瘟，并且文中描述，该病在1949年以前在广东省就已存在，随后在全国各地区均有发现。本病流行范围广，且发病率和死亡率高，严重威胁着我国养鸭业的发展。
[0003]DPV潜伏感染却表现临床健康是鸭瘟流行病学特征之一，在条件适宜时引起鸭瘟的爆发流行。Shawky等首次确认DPV潜伏的主要部位为三叉神经节，同时少数淋巴细胞中也能够检测出DPV。耐过鸭在感染4年后仍能向外界排毒。在宿主免疫力降低等情况下，潜伏在耐过鸭体内的病毒能够被再次激活，导致鸭瘟的二次爆发和流行，因此，如何诊断鉴定鸭瘟病毒至关重要。
[0004]鸭瘟病毒基因组庞大，共有78个ORF，大小约为160kb，不同DPV毒株的全基因组核苷酸序列具有高度相似性，但强毒株和弱毒株在一些ORF处存在序列差异。根据鸭瘟强、弱毒株在UL2基因处的序列差异，Xie L等对比较了10株DPV强毒和11株鸭瘟弱毒的UL2基因序列后发现，鸭瘟弱毒均缺失了528bp的UL2基因B片段，并以此建立理论上能够特异性检测鸭瘟强毒的PCR和荧光定量PCR方法，但结果显示，建立的2种方法对鸭瘟强毒株(Yulin2016
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30D株)和5株鸭瘟弱毒株的检测结果均为阳性，说明不能基于UL2基因B片段建立特异性检测或区分鸭瘟强、弱毒株的检测方法，同时，现行检测鸭瘟的国家标准方法也无法有效的区分鸭瘟强、弱毒株。因此，亟需建立一种可区分鸭瘟强、弱毒株的鉴定方法。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供一种用于鉴别强、弱鸭瘟毒株的引物、试剂盒及其鉴别方法，基于拼接后的DPV C
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KCE LORF5 5
’
UTR区的鸭瘟强、弱毒鉴别PCR方法能够对鸭瘟强、弱毒株进行有效准确的鉴定，最低能够检测到0.46pg的DPV强毒和46pg的DPV弱毒。
[0006]为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0007]一种用于鉴别强、弱鸭瘟毒株的引物，其序列如SEQ ID NO.1和2所示。具体序列为：
[0008]强、弱毒鉴别
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F：GATGAATCTCCTCCGCCAT(SEQ ID NO.1)
[0009]强、弱毒鉴别
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R：GTACGTGGTGTAGCCGAAT(SEQ ID NO.2)
[0010]一种用于鉴别强、弱鸭瘟毒株的试剂盒，其包括上述引物。
[0011]进一步地，试剂盒用于鉴定或辅助鉴定待测病毒为鸭瘟强毒株或弱毒株，或检测待测样本是否感染鸭瘟强毒株病毒或弱毒株病毒。
[0012]一种非诊断或治疗目的的对鸭瘟强毒株进行鉴定的方法，包括以下步骤：
[0013](1)提取待测样本DNA；
[0014](2)采用权利要求1所述的组合，或权利要求2所述的试剂盒进行PCR检测，并根据扩增的目的片段大小判断其为强毒株或弱毒株样本。
[0015]进一步地，待测样本DNA来源于棉拭子样本。
[0016]进一步地，PCR反应体系包括2
×
Rapid Taq Master Mix 5μL，10ng/μL的模板1μL，上下游引物浓度分别为0.4μmol/L，最后ddH2O补足至10μL。
[0017]进一步地，PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s；55℃退火15s；72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸5min。
[0018]进一步地，步骤(2)中，若扩增片段为2454bp，则为强毒株样本；若扩增片段为536bp，则为弱毒株样本。
[0019]本专利技术的有益效果：
[0020]现行鸭瘟检测国家标准方法(GB/T 22332
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2008)无法区分鸭瘟强、弱毒，且依赖于组织或血液样本，采样对动物的生产性能影响较大，对采集技术要求较高且DNA提取程序复杂。棉拭子样本在生产中具有采集方便快速、对动物的刺激性小，操作简便，易于被养殖人员掌握等优点，是鸭瘟诊断和检测时的理想样本采集方式。本专利技术所建立的基于鸭瘟拼接后的C
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KCE LORF5 5
’
UTR区的鸭瘟强、弱毒鉴别PCR方法能够对棉拭子样本中的鸭瘟强、弱毒株进行有效准确的鉴定，最低能够检测到0.46pg的DPV强毒和46pg的DPV弱毒，为DPV强、弱毒株的快速鉴别诊断及其流行病学调查提供技术支持。
附图说明
[0021]图1为32株DPV LORF5基因5
’
UTR区序列比对结果；
[0022]图2为X片段电泳检测结果；
[0023]图3为强、弱毒鉴别
‑
F/R引物电泳检测结果；
[0024]图4为DPV CHv模板引物浓度优化结果；
[0025]图5为DPV CHv模板循环次数优化结果；
[0026]图6为DPV CHv退火温度优化结果；
[0027]图7为DPV CVCC AV1222模板引物浓度优化结果；
[0028]图8为DPV CVCC AV1222模板循环次数优化结果；
[0029]图9为DPV CVCC AV1222模板退火温度优化结果；
[0030]图10为鸭瘟强、弱毒混合模板检测结果；
[0031]图11为强、弱毒鉴别
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F/R引物特异性试验结果；
[0032]图12为DPV CHv敏感性试验结果；
[0033]图13为DPV CVCC AV1222敏感性试验结果；
[0034]图14为国标PCR方法对DPV CHv的敏感性试验结果；
[0035]图15为国标PCR方法对DPV CVCC AV1222的敏感性试验结果；
[0036]图16为DPV CHv组口腔拭子检测结果；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴别强、弱鸭瘟毒株的引物，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO.1和2所示。2.一种用于鉴别强、弱鸭瘟毒株的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于鉴定或辅助鉴定待测病毒为鸭瘟强毒株或弱毒株，或检测待测样本是否感染鸭瘟强毒株病毒或弱毒株病毒。4.一种非诊断或治疗目的的对鸭瘟强、弱毒株进行鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待测样本DNA；(2)采用权利要求1所述的组合，或权利要求2所述的试剂盒进行PCR检测，并根据片段长度判断其为强毒株或弱毒株样本。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PC...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴英，程安春，汪铭书，杨琪琪，李玉琪，孙安阳，朱德康，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：