一种检测非洲猪瘟病毒的四重qPCR引物探针组及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测非洲猪瘟病毒的引物探针组，包括用于检测非洲猪瘟病毒B646L基因、Ⅰ型非洲猪瘟病毒EP402R基因、Ⅱ型非洲猪瘟病毒EP402R基因、非洲猪瘟病毒MGF_360

【技术实现步骤摘要】
一种检测非洲猪瘟病毒的四重qPCR引物探针组及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种检测非洲猪瘟病毒的引物探针组及其应用。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起猪的一种急性、热性、高度接触传染性疾病，致死率可高达100％。世界动物卫生组织(WOAH)将其列为必须报告动物疫病,我国将其列为一类动物疫病。自1921年肯尼亚首次爆发ASF后，一直到20世纪中期，ASFV仅在非洲地区流行传播，但1957年传播到了葡萄牙，并进一步在欧洲其他国家扩散开来，2007年格鲁吉亚发生非洲猪瘟并向周围扩散开来，2018年8月，中国沈阳首次发生非洲猪瘟病例，随后在我国各省市蔓延开来，对我国养猪业造成巨大损失。
[0003]非洲猪瘟病毒属于DNA病毒目，是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，是可以由虫媒传播的DNA病毒，病毒粒子呈二十面体对称，直径为约为200nm，外包囊膜，内部含有数个共同轴心的同心圆结构，基因组全长170～196kb，含有150～167个个开放阅读框，可编码150～200种蛋白，根据ASFV的B646L基因C末端序列的差异可分为24个基因型。目前我国已出现基因Ⅰ型和Ⅱ型，不同基因型毒株的B646L基因序列差异小，只能通过测序区分，本专利技术中通过比对基因Ⅰ型和Ⅱ型毒株的EP402R基因，发现存在序列差异，所以设计了针对基因Ⅰ型和Ⅱ型毒株的EP402R基因的引物探针。
[0004]目前，临床中检测非洲猪瘟的方法主要为荧光定量PCR方法，敏感度高，检测时间短，但是由于非洲猪瘟病毒已在我国出现三年多的时间，有研究证明已经出现了自然变异毒株，只检测B646L基因无法区分毒株是否存在基因缺失和毒株的基因型，因此，本专利技术结合荧光定量PCR方法的敏感性高和多通道的优点，建立一种能够同时区分ASFV野毒株的基因型和基因缺失株的多重荧光定量PCR方法，实现了ASFV的鉴别诊断，对临床的防控有很强的指导意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种能够同时区分基因Ⅰ/Ⅱ型非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的四重qPCR检测引物探针组和试剂盒，具有特异性强、灵敏度高、成本低等特点，在鉴别ASFV野毒株的基因型的同时区分野毒株与基因缺失株，为有效防控ASF提供了新的途径。
[0006]本专利技术是通过以下的技术方案实现的：
[0007]能够同时区分基因Ⅰ/Ⅱ型非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的四重qPCR检测引物探针组包括4组引物探针组合，具体序列如下：
[0008]组合1包括以下引物：
[0009]B646L
‑
F:TTACTACTGCGAATACCCCG(SEQ ID NO:1)
[0010]B646L
‑
R:TTCCCTCCACCGATACCTC(SEQ ID NO:2)
[0011]探针B646L
‑
P：CY5
‑
ACGACTTTATGAAAACGTAAGATTCGATGT
‑
BHQ3(SEQ ID NO:9)
[0012]扩增产物的核苷酸序列：
[0013]TTACTACTGCGAATACCCCGGAGAACGACTTTATGAAAACGTAAGATTCGATGTAAATGGAAATTCCCTAGACGAATATAGTTCGGATGTCACAACGCTTGTGCGCAAATTTTGCATCCCAGGGGATAAAATGACTGGATATAAGCACTTGGTTGGCCAGGAGGTATCGGTGGAGGGAA
[0014]组合2包括以下引物：
[0015]Ⅰ型
‑
EP402R
‑
F:TTGTGAGTGGATTAATAATAGGT(SEQ ID NO:3)
[0016]Ⅰ型
‑
EP402R
‑
R:AGTGGTGTCATCGTGAGAAA(SEQ ID NO:4)
[0017]探针Ⅰ型
‑
EP402R
‑
P：FAM
‑
CAATCATATCTGTATTATCTATACGAAG
‑
MGB(SEQ ID NO:10)
[0018]扩增产物的核苷酸序列：
[0019]TTGTGAGTGGATTAATAATAGGTATTTTTATTTCAATCATATCTGTATTATCTATACGAAGAAAAAGAAAAAAACATGTTGAAGAAATAGAAAGTCCACCACCCTCTGAATCTAATGAAGAAGATATTTCTCACGATGACACCACT
[0020]组合3包括以下引物：
[0021]Ⅱ型
‑
EP402R
‑
F:GAAAAGCAGGTAACTTTTGTG(SEQ ID NO:5)
[0022]Ⅱ型
‑
EP402R
‑
R:TATATGTGATATTTGGGGGAG(SEQ ID NO:6)
[0023]探针Ⅱ型
‑
EP402R
‑
P：VIC
‑
ATTTGATACAACATATCAAGTAGTATGG
‑
MGB(SEQ ID NO:11)
[0024]扩增产物的核苷酸序列：
[0025]GAAAAGCAGGTAACTTTTGTGAATGTTCTAATTATAGTACATCAATATATAATATAACAAATAATTGTAGCTTAACTATTTTTCCTCATAATGATGTATTTGATACAACATATCAAGTAGTATGGAATCAAATAATTAATTATACAATAAAATTATTAACACCTGCTACTCCCCCAAATATCACATATA
[0026]组合4包括以下引物：
[0027]MGF_360
‑
13L
‑
F:GCAACATCAACCAAGCTATGC(SEQ ID NO:7)
[0028]MGF_360
‑
13L
‑
R:TGGCAAGGAAGCATCTGA(SEQ ID NO:8)
[0029]探针MGF_360
‑
13L
‑
P：CY5
‑5‑
ATGCCTTTGAAGAGGGTCGTGCC
‑
BHQ3(SEQ ID NO:12)
[0030]扩增产物的核苷酸序列：
[0031]GCAACATCAACCAAGCTATGCTTACTTCAGTACAATATTATAACATCGGTAATATATTTTTCTGTATAGATTTGGGTGGTAATGCCTTTGAA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测非洲猪瘟病毒的引物探针组，其特征在于：包括用于检测非洲猪瘟病毒B646L基因的特异性引物对和探针、用于检测Ⅰ型非洲猪瘟病毒EP402R基因的特异性引物对和探针、用于检测Ⅱ型非洲猪瘟病毒EP402R基因的特异性引物对和探针、用于检测非洲猪瘟病毒MGF_360
‑
13L基因的特异性引物对和探针，其中，用于检测非洲猪瘟病毒B646L基因的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1
‑
2所示；用于检测Ⅰ型非洲猪瘟病毒EP402R基因的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO:3
‑
4所示；用于检测Ⅱ型非洲猪瘟病毒EP402R基因的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO:5
‑
6所示；用于检测非洲猪瘟病毒MGF_360
‑
13L基因的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO:7
‑
8所示。2.如权利要求1所述的引物探针组，其特征在于：用于检测非洲猪瘟病毒B646L基因的特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；用于检测Ⅰ型非洲猪瘟病毒EP402R基因的特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；用于检测Ⅱ型非洲猪瘟病毒EP402R基因的特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示、用于检测非洲猪瘟病毒MGF_360
‑
13L基因的特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。3.如权利要求2所述的引物探针组，其特征在于：所述探针的5
′
端修饰有报告基团，所述报告基团为CY5、FAM、VIC或CY5
‑
5；所述探针的3
′
端修饰有淬灭基团，所述淬灭基团为BHQ3或MGB。4.权利要求1
‑
3任一项所述的引物探针组在制备非洲猪瘟病毒检测试剂盒中的应用，用于区分基因Ⅰ型和Ⅱ型非洲猪瘟病毒并对野毒株和EP402R基因、MGF_360
‑
13L基因缺失毒株进行鉴定，所述检测试剂盒是四重qPCR试剂盒。5.一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1
‑
3任意一项所述的引物探针组。6.如权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有qPCR扩增反应试剂、阴性对照和阳性对照标准品。7.一种非诊断目的检测非洲猪瘟病毒的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：何启盖，李栋凡，于学祥，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：