一种高效促进细胞外泌体分泌技术应用于骨修复材料制备制造技术

本发明专利技术通过脂质体介导Rab27a

【技术实现步骤摘要】
一种高效促进细胞外泌体分泌技术应用于骨修复材料制备


[0001]本专利技术属构建hFOB1.19
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Rab27a细胞进行的基础研究领域,更具体地说，本专利技术涉及脂质体介导Rab27a
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pcDNA3.1
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3xFlag
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C重组质粒转染hFOB1.19细胞,能够分泌具有促成骨分化作用的外泌体。

技术介绍

[0002]外泌体为细胞分泌的微小囊泡，其中含有蛋白、核酸、脂质成分，外泌体具有介导细胞间通讯的作用。近年来，通过外泌体作为药物递送体系，或使用间充质干细胞外泌体进行组织缺损修复治疗受到广泛的关注。间充质干细胞在特定诱导分化条件下进行培养，其分泌的外泌体同样具有促进细胞定向分化的功能，有研究对于成骨前体细胞 hFOB1.19、干细胞BMSCs进行成骨诱导培养并分别提取其外泌体，该外泌体对细胞成骨分化有促进作用。在骨组织工程中，虽然BMSCs作为常用的种子细胞，但是细胞系hFOB1.19较原代提取的BMSCs性质更加标准、稳定，减少了因为供体差异引起的细胞品质差异，适合用于外泌体的标准化提取方案及成分分析研究。
[0003]在外泌体的发生和分泌过程中，Rab27a基因调控在外泌体分泌过时MVB与质膜的锚定对接，促进MVB与质膜融合释放外泌体，研究显示敲低Rab27a基因明显降低了外泌体的分泌水平，造成胞内Alix标记的MVB积聚，但Rab27a表达水平的变化不会引起外泌体成分的改变。

技术实现思路

[0004]本专利技术通过脂质体介导Rab27a
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pcDNA3.1
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C重组质粒转染 hFOB1.19细胞，构建了hFOB1.19
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Rab27a细胞。
附图说明
[0005]图1为本专利技术实施例1Rab27a pcDNA3.1
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C质粒构建示意图。
[0006]图2为本专利技术实施例1重组质粒Rab27a
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pcDNA3.1
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3xFlag
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C的双酶 切鉴定。
[0007]图3为本专利技术实施例1RT
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PCR检测Rab27a的mRNA水平。
[0008]图4为本专利技术实施例1WesternBlot检测Rab27a的蛋白表达水平。
[0009]图5为本专利技术实施例1BCA检测外泌体蛋白浓度。
[0010]图6为本专利技术实施例1WesternBlot检测外泌体表面标志物。
[0011]图7为本专利技术实施例1透射电镜观察外泌体形貌。
[0012]图8为本专利技术实施例1hFOB1.19细胞内化外泌体。
具体实施方式
[0013]以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。
[0014]实施例1：Rab27a转染hFOB1.19细胞的构建及外泌体分泌检测材料与方法细胞和
试剂：质粒Rab27a
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pcDNA3.1
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C(图1)购于武汉金开瑞生物工程有限公司，大肠杆菌DH5α菌种为实验室保藏菌株，小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)实验提取，人成骨细胞系 (hFOB1.19
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Rab27a)实验构建，BCA蛋白浓度试剂盒， Lipofectamine2000脂质体转染试剂盒等购自Invitrogen。
[0015]实验仪器：ABI荧光定量PCR和Nanosight纳米粒径仪购自美国ABI。
[0016]重组质粒鉴定质粒Rab27a
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C购于武汉金开瑞生物工程有限公司，全长6115bp，其中目的基因Rab27a CDS区片段为665bp (NM_023635.6)。在902bp到1069bp为多克隆位点，在多克隆位点前面，有两个增强子/启动子区，一个是CMV enhancer/promoter 区，在多克隆位点前面，供外源基因用；一个是SV40enchancer/promoter区，带动Neomycin抗性基因的表达。质粒带有氨苄抗性基因。
[0017]大肠杆菌DH5α转化重组质粒
[0018]大肠杆菌DH5α菌种为实验室保藏菌株，制成感受态细胞后转化 Rab27a
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C重组质粒。
[0019](1)菌种复苏
[0020]复苏冻存的大肠杆菌DH5α菌种(E.coli DH5α)接种于LB平板中，培养后挑取单菌落接种于5mL LB液体培养基中，37℃振荡培养12h，至OD值为0.6左右，将菌液以1：50
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1：100的比例接种于100mL LB液体培养基中，37℃振荡培养3h，至OD值为0.4 左右。
[0021](2)感受态大肠杆菌制备
[0022]将培养液移至预冷的50mL离心管中，冰上放置30min，4℃3000 g离心10min。离心后弃上清液，加入5mL预冷的CaCl2(0.1mol/L，含15％甘油)重悬细菌，在冰上将菌液分装成200μL/份，4℃放置12
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24h，即成感受态大肠杆菌，可直接用于转化。
[0023](3)重组质粒转化
[0024]取200μL DH5α感受态细菌菌液，加入10μLRab27a
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C重组质粒，混匀，冰浴30min后放入 42℃水浴热休克90s，然后立即转移至冰浴中冷却2min。加入200 μL LB液体培养液，在37℃，180rpm摇床低速振荡培养1h。将菌液涂布于含氨苄霉素抗性琼脂LB固体培养基上，置于37℃的CO2 培养箱中15min，待菌液吸收完全后，倒置培养16
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20h。
[0025]重组质粒提取与鉴定
[0026](1)提取重组质粒DNA
[0027]使用质粒小提取试剂盒提取质粒DNA，取2mL细菌培养物于离心管中，10000g离心1min，弃上清，加入250μL溶液1(含有RNaseA)，充分震荡使沉淀彻底悬浮。向离心管中依次分别加入250μL溶液2、350μL溶液3并充分混匀。10000g离心10min，取上清移，将上清加入吸附柱，至于另一离心管中，室温放置2min，10000g 离心1min，弃液，将吸附柱重新放回收集管中。向洗脱柱中加入750 μL洗柱液，10000g离心1min，弃液，再向其中倒入250μL洗柱液，10000g离心5min后，弃液。向洗脱柱中加入50μL去离子水，静置2min，收集离心液体，
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20℃保存备用。
[0028](2)双酶切鉴定重组质粒
[0029]双酶切反应本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.本发明公开了通过脂质体介导Rab27a
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pcDNA3.1
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C重组质粒转染hFOB1.19细胞，构建hFOB1.19
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Rab27a细胞，高效分泌促成骨分化作用的外泌体。2.权利要求1中的hFOB1.19
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Rab27a细胞构建过程概况为：大肠杆菌DH5α菌种制成感受态细胞后转化Rab27a
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pcDNA3.1
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C重组质粒，使用脂质体转染试剂盒对hFOB1.19细胞进行重组质粒转染即制成hFOB1.19
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【专利技术属性】
技术研发人员：孙晗笑，利时雨，耿承旭，
申请(专利权)人：艾威亚广州医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：