一种含酵母基因工程细胞的3D仿生植入体的制备与应用制造技术

本发明专利技术为一种搭载粘红酵母基因工程细胞的3D仿生植入体的制备与应用。构建了一种多孔膜结构的线性产药植入体(直径3

【技术实现步骤摘要】
一种含酵母基因工程细胞的3D仿生植入体的制备与应用


[0001]本专利技术属组织工程领域，更具体地说，本专利技术涉及一种新型基因工程细胞的3D仿生植入体的应用。
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技术介绍

[0003]生物大分子药物涵盖了重组蛋白、抗体、疫苗、细胞治疗、核酸药物、基因治疗等。重组蛋白质或核酸类药物在重大疾病治疗中发挥极其重要的作用，多用于治疗肿瘤、艾滋病、心脑血管病、肝炎等重大疾病，被认是为21世纪药物研究开发中最有前景的领域之一。目前市售的化学药物、中药等传统药物往往存在水溶性差、易被人体快速清除、生物相容性差、体内分布不理想和向细胞渗透能力低等缺陷，而重组蛋白质或核酸类等生物药物如蛋白质药物也存在易被降解、难以穿透细胞膜、免疫原性、稳定性低等问题，使得许多良好靶点的潜在生物大分子药物的成药率极低。如何提高生物大分子药物的生物利用度，最大程度地保留其生物活性、降低其免疫原性并将其传递至靶部位及靶细胞，也是实现生物大分子药物高效化传递亟待解决的关键问题。
[0004]近年，大分子药物的研发模式已经由传统的新药创制开发模式逐渐转变为包括药物传送系统(drugdeliverysystem，DDS)齐头并进的创新模式。美国FDA批准的新药成品中，约一半属创新型药物传送系统制剂。传统的重组的蛋白(肽)药物体内易被酶降解、半衰期短、免疫原性以及重组核酸类不易被细胞摄取等特点大大限制了应用。近年的细胞外泌体技术已被较多应用于药物运载研究，尤其在生物大分子药物方面显示了巨大的优势。细胞外泌体是通过保守的生物过程特异性分泌的膜泡，具有脂质双层膜结构，其产生的主要过程可概括为：(1)细胞质膜凹陷形成细胞内小泡；(2)细胞内小泡进一步发展形成多泡小体；(3)多泡小体与细胞质膜融合释放外泌体，受体细胞对外泌体的接收可以通过配体
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受体相互作用、胞饮/吞噬或膜融合来实现。根据其产生过程可以看出，外泌体是细胞膜成分的囊泡，其可携带包括脂质、蛋白质、RNA和DNA等多种成分，在较好地保护其包裹成分的同时，也能随血液输送至特定靶向细胞或组织，因此在体内以外泌体传递重组生物药物是一种很好细胞间递送系统。外泌体复杂的组成、可由多种细胞分泌、普遍存在于体液中，使得外泌体发挥着极其重要的生物学效应，也使得人们产生了将这种细胞天然产生的外泌体作为药物包载系统的想法。因此，如何高效地获得包载目标蛋白、核酸的外泌体亟待研究突破。本实验室已发现经转入囊泡类基因的粘红酵母可大量生产外泌体，且在细胞质中重组质粒形成产生的药物分子可被包入外泌体内。
[0005]外泌体作为药物载体进行药物运输有独特的优势，主要体现在：(1)当使用自源外泌体时，外泌体引起的有害免疫反应极低；(2)外泌体在人血液中的稳定性好；(3)向细胞转运“货物”的效率高；(4)外泌体运载药物时具有一定的靶向性；(5)外泌体直径在40～100nm之间，因此可以很好地利用增强渗透滞留(EPR)效应，有选择性地渗入到肿瘤或炎症组织部位。目前已经尝试用外泌体携带siRNA，化学小分子药物等进行基因治疗和肿瘤治疗等研
究。
[0006]利用天然外泌体携带核酸、脂质、蛋白质等物质的特性，可将外泌体作为一种载带核酸、多肽、蛋白质类药物的优良载体。其中外泌体载带RNA类药物的文献目前报道较多，如外泌体载带miR
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26a、长非编码RNA(LncRNA)
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H19、miR
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200b等用于抗肿瘤、糖尿病性创伤、肠纤维化治疗等研究，证明载带RNA的外泌体给药系统有希望成为多种疾病的基因治疗手段。蛋白质类药物主要包括酶、多肽及细胞因子等，因具有特殊的药理活性而成为治疗疾病的一类重要药物，但分子量大、稳定性差等缺点限制其临床应用。近年来，研究显示外泌体作为药物载体可以载带多种蛋白质，实现靶向给药和稳定酶活性等目的。Sterzen
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bach等构建载带Cre重组酶的外泌体递送系统并实现跨越血
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脑屏障的脑部靶向给药，该研究利用分子开关机制实现外泌体装载外源性Cre重组酶，为构建载带外源性蛋白质外泌体递送系统提供了新思路。Yuan等利用天然巨噬细胞分泌的外泌体载带脑源性神经营养因子，实现了脑部炎症病变下的主动靶向给药，为脑部炎症治疗及大脑营养提供了新方法。虽然最初的研究以实现中枢神经系统疾病靶向治疗多见，但近年来非脑部靶向给药的研究也逐渐增多。如Malhotra等构建了载带转铁蛋白和乳清铁蛋白的外泌体递送系统，并实现了全身给药的肿瘤靶向药物递送。
[0007]外泌体不仅可以通过内源内含物对受体细胞起到治疗作用，也可以通过装载外源物质对受体细胞起到治疗的作用。目前利用外泌体装载药物的方式中较为成熟、应用较多的包括两种，一是将药物与外泌体来源细胞共培养，使细胞分泌出的外泌体内自然包含有药物；二是通过化学方法(如脂质体转染法)转染外泌体来源细胞，使其携带药物。外泌体是用于递送生物分子的有吸引力的载体。然而，将功能分子加载到外泌体的机制是相对未被阐明的。但目前对外泌体装载药物的研究较为片面，未系统地解决蛋白、多肽、核酸等多种大分子药物给药途径复制、困难的问题。因此，本研究拟系统地构建外泌体产药的基因工程细胞，通过同源重组导入sec1基因以高效产生外泌体并同时转入药物蛋白表达质粒(如vMIP表达质粒)的基因工程细胞，此细胞可以外泌体的方式释放脂质体
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药物蛋白，以实现重组蛋白质药物的高效化和靶向性传递。
[0008]相较于传统的注射和口服给药途径，以外泌体形式包裹目的药物靶向给药不仅可以改善药物吸收，提高生物利用度；还可以通过靶向给药，改善药物的体内分布，提高药物的组织特异性浓度与药物的靶向性；延长药物的体内循环时间，增强药物疗效。随着美国的3D打印药物Spritam2016年上市以来，3D生物打印的载药植入体已崭露头角，尤其对重组生物药物起到变革作用。本项目的进一步研究可作为3D生物打印载药植入体的植入细胞，此类载药植入体可通过非注射的途径释放药物进入人体，在体内长效地控制药物释放，并将药物输送到靶向器官的体系。
[0009]此类基因工程细胞适用于大多数有明确药物靶点的可表达蛋白，这一生物大分子药物递送体系将为重组蛋白药物的体内高效应用提供良好的技术平台。

技术实现思路

[0010]本专利技术主要目的是构建一种新型的3D仿生载药植入体，其内载入可产生含药外泌体的活体基因工程细胞，植入体内后(如皮下埋置)以外泌体方式持续分泌所表达的重组蛋白、重组肽或重组核酸等生物药物分子。对于3D仿生载药植入体的外层材料，我们拟采用
FDA认证的聚对二氧环已酮(PPDO)材料，制成纳米级多孔膜管。生物相容性好，无抗原性，体内降解生成水和CO2(约8个月降解)，载入细胞分泌的含目的生物药物的脂质外泌体直径为200nm左右，网孔一般在500nm左右，可使内载入细胞不能外逃，且免疫细胞不能进入，保证内载入的产药工程细胞无免疫反应。我们拟采用搭载细胞的水凝胶作为3D仿生载药植入体的内层材料，并可添加细胞培养的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种搭载粘红酵母基因工程细胞的3D仿生植入体的制备与应用。2.权利要求1中所述搭载粘红酵母基因工程细胞的3D仿生植入体，其特征在于使用但不限于二氧环已酮(PPDO)为原材料，运用生物3D打印技术制作纳米级多孔膜管。3.权利要求1中所述搭载粘红酵母基因工程细胞的3D仿生植入体，其特征在于所搭载的内载细胞包括但不限于粘红酵母。4.权利要求3中所述3D仿生植入体所搭载的粘红酵母基因工程细胞，其特征在于通过同源重组法使粘红酵母内sec1囊泡运输基因增强表达，可以稳定大量的产生外泌体。5.权利要求3中所述3D仿生植入...

【专利技术属性】
技术研发人员：利时雨，孙晗笑，邓健善，
申请(专利权)人：艾威亚广州医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：