一种搭载促成骨分化的外泌体微球在骨修复的应用制造技术

本发明专利技术采用GelMA、PEGDA混合Exo作为材料，通过微流控芯片技术制作PEGDA/GelMA/Exo(简称PGExo)微球。本发明专利技术公开了MC3T3细胞过表达Rab27a基因，有效提高了细胞分泌具有成骨分化作用的外泌体水平。通过共聚焦和BCA蛋白浓度测定法测定微球释放外泌体浓度，确定微球搭载的最佳外泌体浓度以及有效缓释时间。通过ALP和茜素红染色证实微球促进BMSCs细胞成骨分化。本发明专利技术为具有促成骨分化作用的外泌体微球在骨修复中的应用。在骨修复中的应用。在骨修复中的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种搭载促成骨分化的外泌体微球在骨修复的应用


[0001]本专利技术属采用微流控芯片制备PEGDA/GelMA/Exo微球(PGExo) 进行的基础研究领域，更具体地说，本专利技术涉及对MC3T3细胞过表达Rab27a基因修饰，提取了具有促成骨分化作用的外泌体，从而促使PGExo微球所搭载的最佳外泌体浓度以及有效的缓释时间。

技术介绍

[0002]骨组织工程的种子细胞—骨髓间充质干细胞(BMSCs)在骨组织工程中的使用尤其广泛，可以迁移到损伤部位参与组织修复，快速地向成骨细胞分化。然而，直接使用BMSCs也存在一定的局限性：采集会对患者本身造成创伤。因此，形成了无细胞支架用于组织工程， BMSCs的旁分泌作用属于一种细胞通讯行为，可通过外泌体(Exo) 介导细胞间信号传递。外泌体较BMSCs具有更多的应用优势：外泌体可由细胞培养液中大量提取；性质稳定可冻干制成粉剂储存；没有免疫原性；传递率高，可通过血脑屏障；利用外泌体搭载药物。上述优势使外泌体替代BMSCs用于骨组织损伤修复治疗成为可能。
[0003]研究显示外泌体对于组织损伤修复有良好的治疗效果，但随着被靶细胞摄取内化或被巨噬细胞捕获，外泌体浓度会较快下降，因而外泌体用于骨组织工程治疗，就要搭配外泌体载量大、可长时间缓释给药的药物递送体系。常用方法如微球载体包载：通过微流控、自组装等方式利用生物材料制成的微球/颗粒混合或包载外泌体，经过微球/颗粒被降解或者发生结构改变，释放外泌体。从而实现持续性缓释给药，维持外泌体释药浓度。
[0004]载药微球是一类被广泛应用的药物递送载体，通过将药物溶解或分散在微球中制成微米级的小球。载药微球的制备工艺和材料种类较多，常用的制备工艺如喷雾干燥法、乳化交联法、相分离法等等。其中利用微流控技术采用乳液法制备微球，可以得到粒径分布均匀的载药微球，该技术简单高效，材料消耗量小，粒径便于调控，受到广泛关注。甲基丙烯酰酸酯化明胶(GelMA)水凝胶是含有大量甲基丙烯酰胺基团和甲基丙烯酸酯集团的明胶衍生物，其中含有明胶的氨基酸序列如 RGD序列和MMP酶解序列，因此具有良好的生物相容性可促进细胞粘附生长，并且在体内可生物降解。GelMA结构中的甲基丙烯酰化取代基决定了其可在光引发剂和紫外光条件下引发自由基聚合交联反应形成水凝胶。聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)是在聚乙二醇PEG的分子末端接枝上C＝C双键，使其可以光固化形成水凝胶。GelMA和PEGDA 混合材料经紫外光交联，会形成两种聚合物分子的双网络水凝胶。

技术实现思路

[0005]本专利技术通过对MC3T3细胞过表达Rab27a基因修饰，提取了具有促成骨分化作用的外泌体(Exo)。采用GelMA、PEGDA混合Exo作为材料，通过微流控芯片技术制作PEGDA/GelMA/Exo(简称PGExo) 微球。
附图说明
[0006]图1为本专利技术实施例1Rab27a
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pcDNA3.1
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3xFlag
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C重组质粒。
[0007]图2为本专利技术实施例1BCA检测外泌体蛋白浓度。
[0008]图3为本专利技术实施例1微流控芯片。
[0009]图4为本专利技术实施例1分散相压力调控时分散相形态的微距相片。
[0010]图5为本专利技术实施例1PGExo微球扫描电镜。
[0011]图6为本专利技术实施例1PGExo微球释放外泌体总浓度。
[0012]图7为本专利技术实施例1PGExo微球5d释放外泌体平均浓度。
[0013]图8为本专利技术实施例1激光共聚焦检测PGExo释放外泌体。
[0014]图9为本专利技术实施例2BMSCs细胞成骨分化染色
具体实施方式
[0015]以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。
[0016]实施例1：微球的制备及外泌体缓释检测
[0017]材料与方法
[0018]细胞和试剂：大肠杆菌DH5α菌种为实验室保藏菌株，制成感受态细胞后转化Rab27a
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pcDNA3.1
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3xFlag
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C重组质粒如图1，使用 Lipofectamine2000脂质体转染试剂盒对MC3T3细胞进行重组质粒转染即制成MC3T3
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Rab27a细胞。BCA蛋白浓度试剂盒， Lipofectamine2000脂质体转染试剂盒等购自Thermo。猪皮明胶、甲基丙烯酸酐、PEGDA等购自Sigma
[0019]实验仪器：微流控压力泵、微距摄像头、倒置激光共聚焦显微镜等购自武汉Mesobiosystem
[0020]外泌体提取
[0021]将MC3T3细胞培养液吸入离心管并按如下梯度离心：4℃条件下，1 000
×
g离心10min,3000
×
g离心30min,10000
×
g离心60min,100 000
×
g离心70min。从沉淀中收集外泌体并重悬于PBS中。提取的外泌体悬液可放置于4℃下保存3d并尽快使用。
[0022]GelMA合成制备
[0023]将10g猪皮明胶在50℃水浴中溶解于100mL PBS溶液中，完全溶解后，以0.5mL/min速度缓慢滴加甲基丙烯酸酐，50℃反应3h。将反应溶液滴加3倍体积的无水乙醇，去除甲基丙烯酸酐副产物，用 50mL离心管3000g离心5min，除去上清，所得沉淀用50℃去离子水溶解后，再次用无水乙醇提纯一次。所得沉淀用50℃去离子水溶解后，放入5k透析袋中40℃透析3d。透析后溶液进行冷冻干燥，冻干产物GelMA避光干燥储存，备用。
[0024]微流控分散相PEGDA/GelMA/Exo材料配制
[0025]将1.5g GelMA在40℃水浴中溶解于10mL PBS溶液中，将1.5g PEGDA室温溶解于10mL PBS溶液中。从成骨诱导培养7d MC3T3
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Rab27a的培养基中提取Exo，外泌体经PKH26染色后，通过 BCA蛋白浓度测定将Exo溶液浓度稀释为10mg/mL、5mg/mL、1 mg/mL。取GelMA溶液、PEGDA溶液、Exo溶液各1mL，加入7.5 mg LAP蓝光引发剂。溶液经0.22μm滤膜过滤除菌后置于15mL 离心管中，作为微流控的分散相溶液。
[0026]微流控流动相材料配制
[0027]取300μL Span80加入2.7mL矿物油，置于15mL离心管中，作为微流控的流动相溶液。
[0028]微流控芯片制备微球
[0029]将装有分散相、连续相溶液的离心管分别连接注压瓶盖，注压瓶盖气路接头一端分别连接至微流控压力泵V1a、V2a接口，注压瓶盖液路接头一段连接微流控芯片的对应接口，确保液路的毛细管下降至离心管底部与材料溶液充分接触。按图2连接微流控芯片，启动压力泵在微距摄像头下观察分散相、连续相溶液交汇处，调节压力泵V1a、V2a 旋钮本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.本发明公开了通过微流控芯片技术制作PEGDA/GelMA/Exo(简称PGExo)微球。2.权利要求1中的外泌体(Exo)，其特征在于：MC3T3
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Rab27a细胞分泌的外泌体，具有成骨分化作用，能够促进组织损伤修复，在骨缺损的修复治疗中显示出优异的治疗效果。3.权利要求2中的MC3T3
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Rab27a细胞构建过程概况为：大肠杆菌DH5α菌种制成感受态细胞后转化Rab27a
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pcDNA3.1
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【专利技术属性】
技术研发人员：利时雨，孙晗笑，耿承旭，邓健善，钟志颖，
申请(专利权)人：艾威亚广州医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：