一种基因工程细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种基因工程细胞，为4

【技术实现步骤摘要】
一种基因工程细胞及其制备方法和应用


[0001]本专利技术是涉及一种基因工程细胞及其制备方法和应用，属于生物基因工程


技术介绍

[0002]NK细胞是机体固有免疫系统的重要成员之一，担负着机体免疫监视的重要作用。NK细胞免疫治疗的主要优势在于NK细胞识别靶细胞不需要预先致敏，可直接攻击病毒感染的细胞和肿瘤细胞，且NK细胞识别和杀伤肿瘤细胞不受MHC
‑
I限制，并且NK细胞过继免疫治疗不引起移植物抗宿主疾病(GVHD)。因此，基于NK细胞的肿瘤免疫治疗具有其独特的优势和良好的应用前景。
[0003]尽管NK细胞过继免疫治疗具有良好的抗肿瘤效应和应用前景，但NK细胞免疫治疗仍然难以常规临床应用，一个重要障碍在于人类NK细胞仅占外周血单核细胞的10～15％，NK细胞在数目上难以满足巨大的临床需要。为解决这一难题，首先要建立高效的NK细胞体外扩增体系，以首先在数量上保证NK细胞的有效供给。
[0004]现有NK细胞扩增技术可归为两类：细胞因子组合物扩增技术和饲养细胞扩增技术。其中饲养细胞扩增技术在扩增倍数和扩增试剂的经济性上均优于细胞因子组合物扩增技术。应用基因工程细胞作为饲养细胞(feeder cell)进行NK细胞体外扩增是一种重要的NK细胞扩增新策略。在以往的研究中有研究者应用CD64、CD86修饰K562细胞构建人工抗原递呈细胞(Artificial antigen present cell,aAPC)，然后将4
‑
1BBL(CD137L)和膜固定(IL15membrane
‑
bound IL
‑
15,mIL
‑
15)等导入此细胞中，构建成CD64
‑
CD86
‑4‑
1BBL
‑
mIL15
‑
aAPC，并利用此人工抗原递呈细胞进行NK细胞体外扩增，这种方法可以获得较强细胞毒性的NK细胞，但NK细胞增殖受到限制，5～6周后细胞不再扩增。另一些研究者将4
‑
1BBL和膜固定IL
‑
21(mbIL
‑
21)直接修饰到K562细胞表面，构建成4
‑
1BBL
‑
mbIL
‑
21
‑
K562细胞，该细胞相对于CD64
‑
CD86
‑4‑
1BBL
‑
mIL15
‑
aAPC更简单易操作，且能诱导产生大规模功能性的NK细胞，但CD64
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CD86
‑4‑
1BBL
‑
mIL15
‑
aAPC和4
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1BBL
‑
mbIL
‑
21
‑
K562均采用IgG4作为膜固定分子的连接片段，扩增得到的NK细胞的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(antibody
‑
dependent cell
‑
mediated cytotoxicity,ADCC)的效应较低。
[0005]而ADCC是NK细胞杀伤肿瘤细胞的重要武器，ADCC高反应性是提高NK细胞抗肿瘤免疫反应的重要手段。因此，抗体与过继NK细胞治疗相结合，是利用ADCC效应提高NK细胞抗肿瘤免疫反应的有效手段。但抗体与NK细胞表面CD16受体持续接触，可通过受体内化或ADAM17依赖的切割，导致CD16水平显著下降，从而影响NK细胞的ADCC效应【Blood 2013,121,3599
–
3608.】【J.Leukoc.Biol.2019,105,1297
–
1303.】。还有研究者发现，IgG1抗体与CD16持续接触可诱导NK细胞耗竭。如利妥昔单抗是IgG1类抗CD20抗体，理应通过与NK细胞表面CD16结合增强NK细胞对白血病细胞的杀伤作用，但实际上利妥昔单抗却降低了NK细胞对白血病细胞的杀伤作用，其原因在于利妥昔单抗通过CD16诱导了NK细胞耗竭【Cancer Research,75(19):4097
‑
4108,2015】。
[0006]由于IgG1与CD16持续接触能够下调CD16表达，诱导NK细胞耗竭，所以现有技术在进行NK细胞体外扩增时均选用IgG4作为连接膜固定分子的胞外片段。IgG4作为连接片段，在NK细胞扩增时CD16表达并不下调，但当此类NK细胞接触到IgG1类抗体药物时，CD16却显著下降，导致ADCC作用大幅降低。

技术实现思路

[0007]针对现有技术存在的上述问题，本专利技术的目的是提供一种基因工程细胞及其制备方法和其在扩增制备具有ADCC高反应性NK细胞中的应用。
[0008]为实现上述专利技术目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0009]本专利技术提供的基因工程细胞，为4
‑
1BBL
‑
mbIL
‑
21
‑
hIgG1
‑
K562细胞，其细胞膜表面能稳定表达4
‑
1BB配体4
‑
1BBL且含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的融合蛋白mbIL
‑
21
‑
hIgG1片段。
[0010]本专利技术上述基因工程细胞的制备，包括如下过程：
[0011]a)构建4
‑
1BBL表达的转座子；
[0012]b)先使4
‑
1BBL转座子与转座酶SB11共转染K562细胞，然后进行流式细胞分选，获得4
‑
1BBL稳定表达的K562细胞，即：4
‑
1BBL
‑
K562细胞；
[0013]c)将mbIL
‑
21蛋白与人源免疫球蛋白1：hIgG1的Fc片段连接成融合蛋白mbIL
‑
21
‑
hIgG1，该融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0014]d)将步骤c)构建的融合蛋白mbIL
‑
21
‑
hIgG1导入步骤b)获得的4
‑
1BBL
‑
K562细胞中，建立4
‑
1BBL
‑
mbIL
‑
21
‑
hIgG1
‑
K562细胞。
[0015]一种实施方案，步骤c)的具体操作如下：
[0016]c1)从4
‑
1BBL/pCR4
‑
TOPO质粒中PCR扩增并回收得到3
’
端包含人源免疫球蛋白1：hIgG1 5
’
端片段的mbIL
‑
21扩增片段；
[0017]c2)根本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因工程细胞，其特征在于：所述基因工程细胞为4
‑
1BBL
‑
mbIL
‑
21
‑
hIgG1
‑
K562细胞，其细胞膜表面能稳定表达4
‑
1BB配体4
‑
1BBL且含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的融合蛋白mbIL
‑
21
‑
hIgG1片段。2.一种制备权利要求1所述基因工程细胞的方法，其特征在于，包括如下过程：a)构建4
‑
1BBL表达的转座子；b)先使4
‑
1BBL转座子与转座酶SB11共转染K562细胞，然后进行流式细胞分选，获得4
‑
1BBL稳定表达的K562细胞，即：4
‑
1BBL
‑
K562细胞；c)将mbIL
‑
21蛋白与人源免疫球蛋白1：hIgG1的Fc片段连接成融合蛋白mbIL
‑
21
‑
hIgG1，该融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；d)将步骤c)构建的融合蛋白mbIL
‑
21
‑
hIgG1导入步骤b)获得的4
‑
1BBL
‑
K562细胞中，建立4
‑
1BBL
‑
mbIL
‑
21
‑
hIgG1
‑
K562细胞。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤c)的具体操作如下：c1)从4
‑
1BBL/pCR4
‑
TOPO质粒中PCR扩增并回收得到3
’
端包含人源免疫球蛋白1：hIgG1 5
’
端片段的mbIL
‑
21扩增片段；c2)根据pfuse
‑
hIgG1质粒序列设计一对含有mbIL
‑
21 3
’
端片段的引物，然后从p...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱诗国，姚超，申伟明，龚陈媛，
申请(专利权)人：上海中医药大学，
类型：发明
国别省市：