一种IPS基因工程细胞的3D仿生植入体的制备与应用制造技术

本发明专利技术为一种搭载vMIP基因工程细胞的3D仿生植入体的制备与应用。构建了一种多孔膜结构的线性产药植入体(直径3

【技术实现步骤摘要】
一种IPS基因工程细胞的3D仿生植入体的制备与应用


[0001]本专利技术属组织工程领域，更具体地说，本专利技术涉及一种新型基因工程细胞的 3D仿生植入体的应用。

技术介绍

[0002]生物大分子药物涵盖了重组蛋白、抗体、疫苗、细胞治疗、核酸药物、基因治 疗等。重组蛋白质或核酸类药物在重大疾病治疗中发挥极其重要的作用，多用于治疗肿瘤、 艾滋病、心脑血管病、肝炎等重大疾病，被认是为21世纪药物研究开发中最有前景的领域 之一。目前市售的化学药物、中药等传统药物往往存在水溶性差、易被人体快速清除、生物 相容性差、体内分布不理想和向细胞渗透能力低等缺陷，而重组蛋白质或核酸类等生物药物 如蛋白质药物也存在易被降解、难以穿透细胞膜、免疫原性、稳定性低等问题，使得许多良 好靶点的潜在生物大分子药物的成药率极低。如何提高生物大分子药物的生物利用度，最大 程度地保留其生物活性、降低其免疫原性并将其传递至靶部位及靶细胞，也是实现生物大分 子药物高效化传递亟待解决的关键问题。
[0003]近年，大分子药物的研发模式已经由传统的新药创制开发模式逐渐转变为包括药物 传送系统(drugdeliverysystem，DDS)齐头并进的创新模式。美国FDA批准的新药成品 中，约一半属创新型药物传送系统制剂。传统的重组的蛋白(肽)药物体内易被酶降解、半 衰期短、免疫原性以及重组核酸类不易被细胞摄取等特点大大限制了应用。近年的细胞外泌 体技术已被较多应用于药物运载研究，尤其在生物大分子药物方面显示了巨大的优势。细胞 外泌体是通过保守的生物过程特异性分泌的膜泡，具有脂质双层膜结构，其产生的主要过程 可概括为：(1)细胞质膜凹陷形成细胞内小泡；(2)细胞内小泡进一步发展形成多泡小体； (3)多泡小体与细胞质膜融合释放外泌体，受体细胞对外泌体的接收可以通过配体
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受体相 互作用、胞饮/吞噬或膜融合来实现。根据其产生过程可以看出，外泌体是细胞膜成分的囊 泡，其可携带包括脂质、蛋白质、RNA和DNA等多种成分，在较好地保护其包裹成分的同 时，也能随血液输送至特定靶向细胞或组织，因此在体内以外泌体传递重组生物药物是一种 很好细胞间递送系统。外泌体复杂的组成、可由多种细胞分泌、普遍存在于体液中，使得外 泌体发挥着极其重要的生物学效应，也使得人们产生了将这种细胞天然产生的外泌体作为药 物包载系统的想法。因此，如何高效地获得包载目标蛋白、核酸的外泌体亟待研究突破。本 实验室已发现经转入囊泡类基因的多能干细胞(ips)可大量生产外泌体，且在细胞质中重 组质粒形成产生的药物分子可被包入外泌体内。
[0004]外泌体作为药物载体进行药物运输有独特的优势，主要体现在：(1)当使用自源外 泌体时，外泌体引起的有害免疫反应极低；(2)外泌体在人血液中的稳定性好；(3)向细胞 转运“货物”的效率高；(4)外泌体运载药物时具有一定的靶向性；(5)外泌体直径在 40～100nm之间，因此可以很好地利用增强渗透滞留(EPR)效应，有选择性地渗入到肿瘤 或炎症组织部位。目前已经尝试用外泌体携带siRNA，化学小分子药物等进行基因治疗和肿 瘤治疗等研究。
性，体内降解生成水和CO2(约8个月降解)，载入细胞分泌的含目的生物药物的脂质外泌 体直径为200nm左右，网孔一般在500nm左右，可使内载入细胞不能外逃，且免疫细胞不 能进入，保证内载入的产药工程细胞无免疫反应。我们拟采用搭载细胞的水凝胶作为3D仿 生载药植入体的内层材料，并可添加细胞培养的营养成分。目前生物3D打印常用甲基丙烯 酸化水凝胶(GelMA)，材料具有细胞粘附位点，易被生物降解(约6个月降解)、无抗原 性，生物相容性良好本专利技术使用高表达Rab27A基因的ips细胞作为植入体的载入细胞。所搭载的多潜能干细胞 (ips)主要依赖于外泌体的旁分泌发挥调控功能，我们对PBMC来源的ips细胞进行同源重 组法使Rab27A基因增强表达，Rab27A基因可使外泌体形成显著增加，形成的囊泡直径为 150左右的纳米级，并可高效包裹胞质中的生物分子。
[0010]本专利技术中的3D仿生植入体，作为一种平台型技术，除了可搭载上述vMIP蛋白外， 后期可以搭载多种其他生物大分子药物，重组蛋白，重组多肽等，从而对不同病症起到治疗 与预防作用。与现有技术相比，这款3D仿生基因工程细胞植入体不仅增加了药物在体内的 持续作用性，起到了良好的预防作用，而且通过使用活细胞分泌外泌体的方式产药，增加了 药物在体内的稳定性，降低了免疫原性。
[0011]附图说明
[0012]图1为转染后稳定高表达Rab27A细胞克隆的筛选(其中Lane 1：iPS细胞；Lane2：空载体细胞；Lane 3：pcDNA3.1(+)
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Rab27A细胞)。
[0013]图2质粒pMD18
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T
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Kex2
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EK菌落PCR(左)及双酶切鉴定(右)图。(注：左： M：DL500 DNA Marker；泳道1：转染pMD18
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T
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Kex2
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EK质粒的菌株；泳道2：转染 pMD18
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T载体的菌株。右：M1：DL4500 DNAMarker；M2：DL500 DNA Marker；泳道1： pMD18
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T
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Kex2
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EK质粒；泳道2：pMD18
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T质粒)。
[0014]图3重组质粒pEGFP
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N3
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vMIP
‑Ⅱ
菌落PCR检测(左)和双酶切鉴定(右)。(注： 左：M为DL2000 DNA Marker；泳道1为Kex2+vMIP
‑Ⅱ
基因PCR产物。右：M为 DL15000 DNA Marker；泳道1为pEGFP
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N3
‑
vMIP
‑Ⅱ
双酶切；泳道2为pEGFP
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N3双酶 切)。
[0015]图4免疫印迹法检测目的蛋白vMIP
‑Ⅱ
表达。(注：泳道1为转染pEGFP
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N3质粒 组；泳道2为转染不含信号肽的pEGFP
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N3
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vMIP
‑Ⅱ
组；泳道3为转染含信号肽的pEGFP
‑ꢀ
N3
‑
vMIP
‑Ⅱ
组)图5 3D仿生植入体示意图。
[0016]图6外泌体粒径qNano分析图。
具体实施方式
[0017]以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。
[0018]实施例重组蛋白或核酸药物以外泌体分泌表达的细胞体系研究1.多潜能干细胞来源的产药外泌体的基因工程载入细胞(ips
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Rab27A)改造多潜能干细胞(iPS)主要依赖于外泌体的旁分泌发挥调控功能，我们对PBMC来源本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种搭载IPS基因工程细胞的3D仿生植入体的制备与应用。2.权利要求1中所述搭载IPS基因工程细胞的3D仿生植入体，其特征在于使用但不限于二氧环已酮(PPDO)为原材料，运用生物3D打印技术制作纳米级多孔膜管。3.权利要求1中所述搭载IPS基因工程细胞的3D仿生植入体，其特征在于所搭载的内载细胞包括但不限于IPS细胞。4.权利要求3中所述3D仿生植入体所搭载的IPS基因工程细胞，其特征在于通过同源重组法使IPS细胞中Rab27A基因增强表达增强表达，使外泌体形成显著增加。5.权利要求3中所述3D仿生...

【专利技术属性】
技术研发人员：利时雨，孙晗笑，邓健善，
申请(专利权)人：艾威亚广州医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：