一种构建可通过药物诱导Cas9蛋白表达的模型猪的方法技术

本发明专利技术公开了一种构建可通过药物诱导Cas9蛋白表达的模型猪的方法。所述方法包括将rtTA调控元件敲入猪细胞基因组Rosa26位点，将Cas9蛋白表达元件敲入猪细胞基因组Hipp11位点，所述rtTA调控元件含有rtTA蛋白编码基因，所述Cas9蛋白表达元件含有TRE3G启动子和Cas9蛋白编码基因，所述TRE3G启动子启动Cas9蛋白编码基因表达。本发明专利技术获得的模型猪可以实现一猪多用，是猪体内简便高效的基因修饰操作的实施基础，模型猪具有可稳定传代的遗传元件，利于推广应用，为猪条件性体内基因组和表观基因组编辑提供强大而灵活的平台，促进基因修饰猪模型在生物医药和农业方面的应用。模型在生物医药和农业方面的应用。模型在生物医药和农业方面的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种构建可通过药物诱导Cas9蛋白表达的模型猪的方法


[0001]本专利技术属于分子生物学
，涉及一种构建可通过药物诱导Cas9蛋白表达的模型猪的方法。

技术介绍

[0002]猪不仅是为人类提供食物的重要家畜，也是生物医学发现的理想模型，它们在免疫系统，解剖学，生理学，器官大小和新陈代谢方面与人类有许多相似之处。尽管基因修饰猪模型并不像啮齿动物模型那样被广泛使用，但迄今为止已经产生了越来越多的对农产品、异种移植和人类疾病模型至关重要的基因修饰猪。由于具有生殖系嵌合能力的猪胚胎干细胞尚未成功建系，目前基因修饰猪主要通过直接胚胎显微注射包含CRISPR的组分或应用CRISPR系统在体细胞中进行基因编辑，然后进行体细胞核移植(SCNT)克隆，然而这两种方法繁琐，费力，低效且耗时。
[0003]有研究报道通过将SpCas9和sgRNA的表达载体直接递送到成年小鼠的特定组织中直接进行体内基因组编辑(Platt et al.,2014,Sanchez
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Rivera et al.,2014,Xue et al.,2014,Swiech et al.,2015,Dow et al.,2015)，然而，总体编辑效率较低，为了克服这个问题，进一步构建了Cre依赖性SpCas9表达盒特异性插入Rosa26基因座的小鼠模型，随后，将靶向目的基因的sgRNA和Cre引入特定的体内器官/组织/细胞，以此简便有效地进行体内基因组编辑。最近，组成型表达Cas9的动物模型(例如ROSA26
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SpCas9转基因猪)的产生显著降低了病毒载体的包装大小和需要递送的组分的数量，从而促进了体内基因编辑。然而，由不可控制的SpCas9表达引起的基因组损伤(XU S X,KIM J,TANG Q S,et al.2020.CAS9 is a genome mutator by directly disrupting DNA
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PK dependentDNArepair pathway.Protein&Cell[J],11:352
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365.)，脱靶效应(FU Y F,FODEN J A,KHAYTER C,et al.2013.High
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frequency off
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target mutagenesis induced by CRISPR
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Cas nucleases in human cells.Nature Biotechnology[J],31:822
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+.)和免疫清除反应将阻碍具有该组成型SpCas9表达系统的动物模型的应用，这对于基于Cre重组酶系统的诱导型表达系统也是不可避免的，因为Cre激活后存在可持续的组成型SpCas9表达。此外，Cre重组酶被证实对猪胚胎发育产生负面影响(WHITWORTH K M,CECIL R,BENNE J A,et al.2018.Zygote injection ofRNA encoding Cre recombinase results in efficient removal ofLoxP flanked neomycin cassettes in pigs.Transgenic Research[J],27:167
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178.)并且在哺乳动物基因组中具有假重组位点的潜在遗传毒性。
[0004]综上所述，提供一种高效构建基因修饰模型猪的方法，对于疾病治疗和药物研发领域具有重要意义。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种构建可通过药物诱导Cas9蛋白表达的模型猪的方法，构建可通过药物诱导Cas9蛋白表达的模型猪，以期解决目前Cas9蛋
白在大动物猪上直接进行体内递送存在成本高、效率低、免疫原性大等问题，以及Cas9蛋白的长期或持续性表达引起的脱靶、基因组损伤等问题。
[0006]为达上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供一种构建可通过药物诱导Cas9蛋白表达的模型猪的方法，所述方法包括：
[0008]将rtTA调控元件敲入猪细胞基因组Rosa26位点，将Cas9蛋白表达元件敲入猪细胞基因组Hipp11位点，所述rtTA调控元件含有rtTA蛋白编码基因，所述Cas9蛋白表达元件含有TRE3G启动子和Cas9蛋白编码基因，所述TRE3G启动子启动Cas9蛋白编码基因表达。
[0009]本专利技术通过将二元Tet
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On元件，rtTA调控元件和TRE3G控制的Cas9蛋白表达元件分别敲入猪细胞基因组ROSA26和HIPP11位点，以此构建多西环素(Doxcycline，Dox)诱导Cas9蛋白表达的(Doxcycline Induced Cas9，DIC)模型猪，其允许通过体外和体内简单的化学诱导实现灵活地时间控制猪中的Cas9蛋白活性，只有在Dox存在的情况下，rtTA和Dox才能结合到TRE3G启动子，从而激活TRE3G启动子启动Cas9和红色荧光蛋白表达。利用这种模型猪，通过简单地将向导RNA(gRNA)传递至猪胎儿成纤维细胞(PFF)和/或特定组织中并在Dox诱导后，可以实现体外和/或体内基因编辑(基因敲除或基因激活)和染色体工程。与啮齿类相比，免疫系统和人类更相似的猪，通过体内基因突变建立癌症动物模型具有明显优势。DIC模型猪克服了Cas9蛋白的体内递送难题，避免了组成型Cas9表达的副作用，并消除了潜在的Cre介导的遗传毒性，这将为猪条件性体内基因组和表观基因组编辑提供强大而灵活的平台，促进基因修饰猪模型在生物医药和农业方面的应用。
[0010]优选地，所述rtTA调控元件敲入Rosa26位点的第一个内含子中。
[0011]优选地，所述rtTA蛋白编码基因的核酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。
[0012]优选地，所述Cas9蛋白编码基因包括SpCas9蛋白编码基因。
[0013]优选地，所述SpCas9蛋白编码基因的核酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列。
[0014]优选地，所述TRE3G启动子的核酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列。
[0015]优选地，所述rtTA调控元件还含有药物筛选标记基因。
[0016]优选地，所述药物筛选标记基因包括neo基因。
[0017]优选地，所述neo基因的核酸序列包括SEQ ID NO.4所示的序列。
[0018]优选地，所述rtTA调控元件的核酸序列包括SEQ ID NO.5所示的序列。
[0019]优选地，所述Cas9蛋白表达元件还含有药物筛选标记基因。
[0020]优选地，所述药物筛选标记基因包括puro基因。
[0021]优选地，所述puro基因的核酸序列包括SEQ ID NO.6所示的序列。
[0022]本专利技术中，所述药物筛选标记基因本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建可通过药物诱导Cas9蛋白表达的模型猪的方法，其特征在于，所述方法包括：将rtTA调控元件敲入猪细胞基因组Rosa26位点，将Cas9蛋白表达元件敲入猪细胞基因组Hipp11位点；所述rtTA调控元件含有rtTA蛋白编码基因；所述Cas9蛋白表达元件含有TRE3G启动子和Cas9蛋白编码基因，所述TRE3G启动子启动Cas9蛋白编码基因表达。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述rtTA调控元件敲入Rosa26位点的第一个内含子中。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述rtTA蛋白编码基因的核酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列；优选地，所述Cas9蛋白编码基因包括SpCas9蛋白编码基因；优选地，所述SpCas9蛋白编码基因的核酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列；优选地，所述TRE3G启动子的核酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列。4.根据权利要求1
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3任一项所述的方法，其特征在于，所述rtTA调控元件还含有药物筛选标记基因；优选地，所述药物筛选标记基因包括neo基因；优选地，所述neo基因的核酸序列包括SEQ ID NO.4所示的序列；优选地，所述rtTA调控元件的核酸序列包括SEQ ID NO.5所示的序列。5.根据权利要求1
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4任一项所述的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：赖良学，王可品，金琴，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：