一种可用于人原代细胞基因编辑的Cas9蛋白的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种可用于人原代细胞基因编辑的Cas9蛋白的制备方法，尤其是涉及一种阴离子交换层析法纯化Cas9蛋白的方法，使用所述方法纯化得到的Cas9蛋白经体外切割试验证明具有体外活性，可特异切割DNA序列；同时经过改造的Cas9蛋白N端和C端带有核定位序列，经电转化进入人原代细胞后可对特定基因进行敲除，证明纯化的Cas9蛋白具有体内活性。明纯化的Cas9蛋白具有体内活性。明纯化的Cas9蛋白具有体内活性。

【技术实现步骤摘要】
一种可用于人原代细胞基因编辑的Cas9蛋白的制备方法


[0001]本专利技术涉及蛋白纯化
，更具体地，涉及一种可用于人原代细胞基因敲除的Cas9蛋白的制备方法。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas是从细菌和古生菌对抗外来病毒或质粒的适应性免疫系统发展而来的新型核酸酶系统，包括三种不同的类型，其中TypeⅡ型的CRISPR/Cas系统的DNA内切酶Cas9只有一个亚基，结构最为简单，应用也最广泛。TypeⅡ型的CRISPR/Cas系统由导向序列sgRNA和核酸酶Cas9两种元件组成。sgRNA的作用是识别基因组中核苷酸序列为5
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NGG-3
’
的PAM基序，依据碱基互补配对原则与靶向序列结合，Cas9在sgRNA的引导下，特异性切割靶向序列，实现基因的插入和敲除。与ZFN、TALEN相比，CRISPR/Cas9系统具有操控性强、特异性高、用途广泛等优点。
[0003]目前，CRISPR/Cas系统可以用于在体内外进行特定位点的基因编辑，多篇文献报道中利用sgRNA文库实现了细胞水平的基因本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种去除内毒素的Cas9蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤1)将Cas9基因克隆到pGEX-4T-1载体上，插入GST标签切割位点，转化至原核表达菌株，诱导表达；2)破碎菌体并收集蛋白上清液进行GST标签结合柱纯化，并酶切GST标签；3)收集步骤2)的流穿液，调节其pH和离子强度，再使用阴离子交换柱去除杂质；4)收集步骤3)的Cas9蛋白，超滤管浓缩得到高浓度且去除内毒素的Cas9蛋白。2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤3)使用阴离子交换柱去除杂质包括如下步骤：S1.活化、平衡树脂：将阴离子交换柱置于层析系统，调节系统流速为1mL/min，冲洗5个柱体积的平衡液20mM Tris+50mM NaCl，pH8.0；S2.上样：将10mL的上样蛋白匀速推入上样环，流速为1mL/min；S3.样品收集：观察UV280的变化，当UV280成上升趋势时，收集流穿峰蛋白；S4.杂质及内毒素洗脱：用洗脱液20mM Tris+1M NaCl冲洗柱子，直到冲出杂质及内毒素，收集洗脱峰；S5.柱体再生保存：洗脱峰结束以后，对柱子进行CIP，最后冲水至中性，再冲洗20％的乙醇保护柱子，取下柱子常温保存。3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤1)所述插入的GST标签切割位点包括Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln
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Gly-Pro，即PreScission Protease的识别序列；Leu-Val-Pro-Arg
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Gly-Ser，即Thrombin的识别序列；Ile-Glu/Asp-Gly-Arg
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即Factor Xa的识别序列，或Asp-Asp-Asp-Asp-Lys
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即Enterokinase的识别序列。4.根据权利要求1或2所述制备方法，其特征在于，步骤1)所述Cas9蛋白的诱导表达条件为：按照1:100的接种量，将表达的菌株接种...

【专利技术属性】
技术研发人员：龙飞，张亚莉，岳江嫚，弓蒙蒙，胡金芳，张丽琴，
申请(专利权)人：西安宇繁生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：