BCMA特异性嵌合抗原受体T细胞及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种针对人BCMA的特异性嵌合抗原受体(anti‑BCMA scFv‑CD8a‑41BB‑CD3ζ)及其应用，该嵌合抗原受体由单链抗体anti‑BCMA scFv，铰链区、跨膜区，胞内区串联构成，该嵌合抗原受体用于修饰人T淋巴细胞，修饰后的T淋巴细胞用于表面BCMA阳性肿瘤的预防与治疗以及肿瘤药物的制备。

BCMA-specific chimeric antigen receptor T cells and their application

The invention discloses a chimeric antigen receptor (anti BCMA scFv CD8a 41BB CD3) for human BCMA and its application. The chimeric antigen receptor consists of single-chain antibody anti BCMA scFv, hinge region, transmembrane region and intracellular region in series. The chimeric antigen receptor is used to modify human T lymphocyte and the modified T lymphocyte is used for the prevention and treatment of BCMA-positive tumors on the surface. Therapy and preparation of cancer drugs.

【技术实现步骤摘要】
BCMA特异性嵌合抗原受体T细胞及其应用
本专利技术涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，具体涉及利用基因工程技术获得了一种嵌合抗原受体anti-BCMAscFv-CD8a-41BB-CD3ζ和该嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，被修饰的T淋巴细胞可以特异性的识别和杀伤表面表达BCMA的肿瘤细胞，所述肿瘤细胞优选为多发性骨髓瘤细胞。
技术介绍
完整抗体的相对分子质量较大。仅由抗体重链V区(VH)与轻链V区(VL)通过人工合成的连接肽(linker)连接而成的小分子抗体称为单链抗体(singlechainantibodyfragment，scFv)。单链抗体相对分子质量小，易于构建和表达，而且其免疫原性弱，不易引起超敏反应和排斥反应。单链抗体是目前研究最活跃的基因工程抗体之一。由单链抗体与毒素或免疫效应分子通过DNA重组工程制备的融合蛋白以及胞内表达的单链抗体等在疾病研究与治疗中展现了良好的前景。多发性骨髓瘤(multiplemyeloma，MM)是一种由成熟浆细胞在骨髓中恶性增殖累积导致骨破坏和骨髓衰竭的常见的血液系统恶性肿瘤。据统计，MM约占所有人类恶性肿瘤的1％，占血液系统恶性肿瘤的10％，MM在美国的发病率(1/100000)为3.5～4.5，中国约为1，中位发病年龄在美国为68岁，在我国则相对较低。MM患者通常表现出骨疼痛、贫血、溶骨性病变、高钙血症、肾功能损害、血细胞减少症、症状性浆细胞产生等症状。传统的化疗、造血干细胞以及近年来使用的蛋白酶体抑制剂虽然都有一定的疗效，患者的总体生存率得到了提高，但仍无法完全治愈。BCMA(Bcellmaturitionantigen，B细胞成熟抗原)属于TNF受体家族成员，在成熟B细胞分化到浆细胞阶段表达，由于其具有mRNA限制性的特点，BCMA并不会表达于人体主要的器官中，这与目前所应用的大多数单抗类作用于所有B系细胞的特点相比，特异性更强，副作用更小。嵌合抗原受体修饰的T细胞(chimericantigenreceptor，CAR-T)治疗是利用基因工程技术，借助逆转录病毒或者逆转病毒载体或者mRNA转导，使得T细胞获得可以识别肿瘤表面抗原，杀伤肿瘤的嵌合抗原受体。CAR-T治疗相比于传统的治疗方法展现出巨大的优势，具体体现在杀伤肿瘤精准性高，CAR-T细胞治疗采用抗原抗体特异性结合的技术，只有表面表达抗原的肿瘤细胞被杀伤，对正常细胞的伤害小；杀伤肿瘤范围广泛，只要表达肿瘤相关抗原，CAR-T细胞就能清除，对于转移性肿瘤、复发性肿瘤均有效；对于患者而言避免了放化疗的痛苦，恢复健康迅速。首次临床应用的报道是2008年，在Naturemedicine上报道了使用CAR-T细胞治疗11例儿童成纤维神经瘤，6例好转的病例。目前的临床应用，主要集中在白血病上，针对的是CD19、CD20、CD22三个靶向位点。在2011和2013年，先后在NEJM上发表了个案报道，描述了运用CAR-T细胞治疗慢性和急性白血病的病例。2014年7月FDA授予诺华公司开发的个性化CAR-T癌症疗法CTL019突破性药物认证，2017年8月，美国FDA核准该药(商品名Kyrmiah)上市。但是，CAR-T也并不是那么完美。鉴于目前病例数量有限，所以无法得出一个系统的疗效结论。并且已有病例结果显示，部分患者CAR-T细胞回输治疗后有较为严重的临床副反应，更有甚者，有些CAR-T的识别失误导致其攻击正常细胞，即所谓的“脱靶效应”。截止目前，已经有研究证实对靶抗原亲和力和杀伤能力强的CAR-T细胞在清除肿瘤的同时也会攻击正常组织，造成组织器官的损伤，在2010年，报道了1例结直肠癌合并肝肺转移的患者在接受人表皮生长因子受体2的CAR-T治疗后因脱靶效应而死亡。由此可见，本领域需要特异性的胞外靶向连接区，其能够特异性的对目标抗原进行识别，避免错误识别的影响。本专利技术人公开了一种针对人BCMA的特异性嵌合抗原受体及其应用，所述CAR能够特异性的结合到靶抗原上，并发挥细胞毒效应。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种靶向BCMA的嵌合抗原受体(anti-BCMAscFv-CD8a-41BB-CD3ζ)，该嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞可以特异性的识别并杀伤表面表达BCMA分子的肿瘤细胞，以及制备治疗肿瘤药物。本专利技术的第一方面，涉及一种嵌合抗原受体anti-BCMAscFv-CD8a-41BB-CD3ζ，所述嵌合抗原受体包括单链抗体anti-BCMAscFv，铰链区、跨膜区，胞内区。优选的，所述单链抗体anti-BCMAscFv由抗人BCMA单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区串联而成，所述的抗人BCMA单克隆抗体来源于BCMA免疫小鼠的杂交瘤细胞。所述铰链区和所述跨膜区均来源于人的CD8a区基因。所述胞内区由共刺激因子4-1BB和CD3ζ串联构成，即为人4-1BB胞内区及人CD3ζ胞内区。本专利技术所述的嵌合抗原受体anti-BCMAscFv-CD8a-41BB-CD3ζ还包括人的CD8α信号肽区，优选的，在所述CD8α信号肽区氨基端对应的基因序列引入Kozak序列和/或酶切位点序列。优选的，所述抗人BCMA单克隆抗体的重链可变区的互补性决定区CDR-H1～CDR-H3的氨基酸序列如SEQIDNO：1-5所示，所述抗人BCMA单克隆抗体的轻链可变区的互补性决定区CDR-L1～CDR-L3的氨基酸序列如SEQIDNO：6-8所示。本专利技术所述的单链抗体anti-BCMAscFv的氨基酸序列如SEQIDNO：9或SEQIDNO：10所示，或至少与SEQIDNO：9或SEQIDNO：10有约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.4％、99.5％、99.7％、99.8％或99.9％的氨基酸序列一致性的序列。所述的单链抗体anti-BCMAscFv的核苷酸序列如SEQIDNO：11或SEQIDNO：12所示。所述的anti-BCMAscFv的轻链和重链之间由氨基酸序列为GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer的连接肽连接而成。在本专利技术的一个实施例中，所述铰链区和跨膜区串联连接，所述氨基酸序列如SEQIDNO：15所示，所述铰链区和跨膜区串联的核苷酸序列如SEQIDNO：16所示。所述胞内区4-1BB-CD3ζ的氨基酸序列如SEQIDNO：17所示，所述胞内区4-1BB-CD3ζ的核苷酸序列如SEQIDNO：18所示。所述CD8α信号肽区的氨基酸序列如SEQIDNO：13所示，所述的CD8α信号肽区的核苷酸序列如SEQIDNO：14所示。本专利技术所述的嵌合抗原受体anti-BCMAscFv-CD8a-41BB-CD3ζ，选自下列组中的一种：a)嵌合抗原受体anti-BCMAscFv-CD8a-41BB-CD3ζ的氨基酸序列如SEQIDNO：19或20所示的序列的部分或全部所示；b)嵌合抗原受体anti-BCMAscFv-CD8a-41BB-CD3ζ的氨基酸序列与SEQIDNO：19或20所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种嵌合抗原受体anti‑BCMAscFv‑CD8a‑41BB‑CD3ζ，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括单链抗体anti‑BCMAscFv，铰链区、跨膜区和胞内区。

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体anti-BCMAscFv-CD8a-41BB-CD3ζ，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括单链抗体anti-BCMAscFv，铰链区、跨膜区和胞内区。2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体anti-BCMAscFv-CD8a-41BB-CD3ζ，其特征在于，所述单链抗体anti-BCMAscFv由抗人BCMA单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区串联而成，所述的抗人BCMA单克隆抗体来源于BCMA免疫小鼠的杂交瘤细胞。3.根据权利要求1-2任一所述的嵌合抗原受体anti-BCMAscFv-CD8a-41BB-CD3ζ，其特征在于，所述铰链区和所述跨膜区均来源于人的CD8a区。4.根据权利要求1-3任一所述的嵌合抗原受体anti-BCMAscFv-CD8a-41BB-CD3ζ，其特征在于，所述胞内区为人4-1BB胞内区及人CD3ζ胞内区。5.根据权利要求1-4任一所述的嵌合抗原受体anti-BCMAscFv-CD8a-41BB-CD3ζ，其特征在于，还包括人的CD8α信号肽区。6.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体anti-BCMAscFv-CD8a-41BB-CD3ζ，其特征在于，在所述CD8α信号肽区氨基端对应的基因序列引入Kozak序列和/或酶切位点序列。7.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体anti-BCMAscFv-CD8a-41BB-CD3ζ，其特征在于，所述抗人BCMA单克隆抗体的重链可变区的互补性决定区CDR-H1～CDR-H3的氨基酸序列如SEQIDNO：1-5所示，所述抗人BCMA单克隆抗体的轻链可变区的互补性决定区CDR-L1～CDR-L3的氨基酸序列如SEQIDNO：6-8所示。8.根据权利要求1-7任一所述的嵌合抗原受体anti-BCMAscFv-CD8a-41BB-CD3ζ，其特征在于，所述的单链抗体anti-BCMAscFv的氨基酸序列如SEQIDNO：9或SEQIDNO：10所示，所述的单链抗体anti-BCMAscFv的核苷酸序列如SEQIDNO：11或SEQIDNO：12所示。9.根据权利要求1-8任一所述的嵌合抗原受体anti-BCMAscFv-CD8a-41BB-CD3ζ，其特征在于，所述铰链区和跨膜区串联连接，其氨基酸序列如SEQIDNO：15所示，所述铰链区和跨膜区串联的核苷酸序列如SEQIDNO：16所示。10.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体anti-BCMAscFv-CD8a-41BB-CD3ζ，其特征在于，所述胞内区4-1BB-CD3ζ的氨基酸序列如SEQIDNO：17所示，编码所述胞内区4-1BB-CD3ζ的核苷酸序列如SEQIDNO：18所示。11.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体anti-BCMAscFv-CD8a-41BB-CD3ζ，其特征在于，所述的CD8α信号肽区的氨基酸序列如SEQIDNO：13所示，编码所述CD8α信号肽区的核苷酸序列如SEQIDNO：14所示。12.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体anti-BCMAscFv-CD8a-41BB-CD3ζ，其特征在于，选自下列组中的一种：a)嵌合抗原受体anti-BCMAscFv-CD8a-41BB-CD3ζ的氨基酸序列如SEQIDNO：19或20所示的序列的部分或全部所示；b)嵌合抗原受体anti-BCMAscFv-CD8a-41BB-CD3ζ的氨基酸序列与SEQIDNO：19或20所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；c)编码嵌合抗原受体anti-BCMAscFv-...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈毓，胡金芳，李燕，张丽琴，龙飞，
申请(专利权)人：西安宇繁生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：陕西,61