人促皮质素又称促肾上腺皮质激素（ACTH），目前是临床治疗两岁以下婴儿惊厥症的唯一特效药。人血清白蛋白（ALB）在体内具有稳定其它蛋白质的作用。本发明专利技术通过基因工程技术，优化设计并构建基因重组ACTH与ALB的融合蛋白表达质粒，并在BL21‑DE3菌株中表达。ACTH与ALB通过组织型纤溶酶原激活剂的底物识别序列（tPAst）相连接起，tPAst在体内可以被组织型纤溶酶原激活剂识别并水解，从而可以逐渐释放出游离的ACTH与ALB。
A fusion protein of recombinant human corticotropin and albumin and its expression method
Human corticotropin, also known as adrenocorticotropic hormone (ACTH), is currently the only specific drug for the treatment of convulsions in infants under two years of age. Human serum albumin (ALB) can stabilize other proteins in vivo. The fusion protein plasmid of gene recombinant ACTH and ALB is optimized and constructed by genetic engineering technology, and expressed in BL21 DE3 strain. ACTH and ALB are connected by tissue plasminogen activator substrate recognition sequence (tPAst). tPAst can be recognized and hydrolyzed by tissue plasminogen activator in vivo, thus releasing free ACTH and ALB gradually.
【技术实现步骤摘要】
一种基因重组人促皮质素与白蛋白的融合蛋白及表达方法
本专利技术属于基因工程制药，涉及一种利用微生物表达的基因重组融合蛋白及其DNA和蛋白质序列，以及该融合蛋白的表达方法。
技术介绍
促皮质素(Corticotropin)也称促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotropichormone，ACTH)，是由垂体的前叶、下丘脑、肾上腺髓质、肠道和胎盘等组织分泌的一种39个氨基酸的多肽类激素，具有调节糖、脂肪、和蛋白质的生物合成和代谢，调节心脑血管功能、提高抵抗力，调控糖皮质激素(GC)的合成与分泌，神经损伤恢复与再生，抗炎，免疫抑制，抗毒素，抗休克等作用。ACTH是临床治疗两岁以下婴儿惊厥症的唯一特效药，该病发病率0.5％～1％，6～33％的婴儿惊厥症患儿在3岁前死亡，70～90％患儿智力发育缓慢，30％发展为自闭症。ACTH也用于红斑狼疮、多发性硬化病急性恶化、肾病综合征、全身性皮肌炎和结节病的治疗；还用于银屑病关节炎、风湿性关节炎、强直性脊柱炎以及严重眼部过敏和炎症等的辅助治疗。目前医药市场上流通的注射用人促肾上腺皮质激素(简称促皮质素，ACTH)主要有两个来源：一是在动物脏器中提取，生产成本高并且有传播动物病毒和支原体的潜在风险。二是由人工合成具有生物活性的ACTH前24肽，其工艺复杂、成本高、产量小、半衰期较短,并且化学合成的方法不易控制其产物旋光性。ACTH在血液中容易被蛋白酶降解，血浆半衰期很短。本专利技术从工程菌中表达制备基因重组ACTH融合蛋白，生产成本低，基本不会传播动物病毒和支原体。人血清白蛋白(ALB)是人体血液中含量最多的蛋白质，含有585个氨基酸，具有结合其它化合物、维持血液渗透压、抗凝血、清除自由基、增强人免疫力和抵抗力等作用，其在体内的半衰期较长，约为19天。ALB制剂在临床上广泛用于烧伤和严重失血等引起的休克、急性缺血性脑卒中、肾病综合症、肝硬化、肺性脑病、糖尿病性肾病和皮肤溃烂等。人血清白蛋白可以保护与其结合的蛋白质不被血浆中的各种蛋白酶降解，从而延长蛋白质在血浆中的半衰期。组织型纤溶酶原激活剂(tPA)是血液中的一种蛋白酶，它可以特异性识别底物蛋白质当中的酶切识别位点序列“CPGRVVGG”(简称为tPAst)，并在该位点处将底物蛋白质切割成两段。在本专利技术表达的融合蛋白中，以tPAst连接ACTH与ALB，形成融合蛋白结构ACTH-tPAst-ALB，当融合蛋白被注射入血液后，血液中tPA的作用下，ACTH-tPAst-ALB融合蛋白会逐渐释放出游离的ACTH及ALB蛋白。构建的表达ACTH与ALB的融合蛋白的表达质粒在本专利中称为ACTH-tPAst-ALB-pET21a。其中tPAst为如上所述组织型纤溶酶原激活剂底物序列(氨基酸序列为CPGRVVGG)。
技术实现思路
1.专利技术的目的利用工程菌表达及制备一种基因重组融合蛋白(ACTH-tPAst-ALB)的方法，ACTH与ALB通过tPAst氨基酸序列相连，tPAst在血液中可以被蛋白酶tPA识别并切割成两段。2.专利技术的技术方案一、使用设计的引物以及重叠PCR技术将编码ACTH、tPAst和ALB的核苷酸序列相连，构建两端带有内切酶位点(BamHI和SalI)的cDNA架构：BamHI-ACTH-tPAst-ALB-SalI。二、双酶切BamHI-ACTH-tPAst-ALB-SalI以及空白载体pET21a，产生互补的粘性末端。三、用T4连接酶将切出粘性末端的BamHI-ACTH-tPAst-ALB-SalI以及pET21a空白质粒连接，构建出表达ACTH-tPAst-ALB(图1)的pET21a表达质粒。四、将构建好的质粒转入大肠杆菌工程菌株BL21-DE3中，筛选高表达菌株，诱导表达。五、破碎菌体，收集包涵体并洗涤。在破碎和溶解包涵体，得到富含ACTH-tPAst-ALB的溶液。3.专利技术的有益效果本专利技术可以获得具有ACTH和ALB双重功效的融合蛋白ACTH-tPAst-ALB，融合蛋白ALB-tPAst-ACTH在人体血液中能够被tPA识别。tPA可以将含有tPAst氨基酸序列(CPGRVVGG)的融合蛋白质切成两段，从而逐步释放出游离的ACTH和ALB。发挥类似缓释长效制剂的作用，同时可以增强ACTH的作用。附图说明图1.ACTH-tPAst-ALB-pET21a表达质粒图谱，ACTH-tPAst-ALB逆时针转录。图2.BamHI-ACTH-tPAst的PCR扩增产物结果图。图3.tPAst-ALB-SalI的PCR扩增产物结果图。图4.ACTH-tPAst-ALB-pET21a表达质粒的BamHI及SalI双酶切验证结果。M：分子量标记；泳道1：ACTH-tPAst-ALB-pET21a表达质粒的BamHI及SalI双酶切电泳结果图；小片段为ACTH-tPAst-ALB，大片段为pET21a载体骨架片段；泳道2：pET21a空白质粒。图5.ACTH-tPAst-ALB基因序列1-638nt正向测序图，其中1-3nt为起始密码子ATG，4-120nt编码ACTH，121-144nt编码tPAst。图6.ACTH-tPAst-ALB基因序列639-1276nt正向测序图。图7.ACTH-tPAst-ALB基因序列1277-1587nt正向测序图。图8.ACTH-tPAst-ALB基因序列1588-1908nt反向测序图，最后9个碱基为三联终止密码子TAATAATAA。图9.在BL21-DE3工程菌中表达的ACTH-tPAst-ALB蛋白质电泳结果。表达的蛋白质分别经SDS-PAGE(12％Tris-Glycine聚丙烯酰胺凝胶)分离后，用考马斯亮蓝R-250原位染色，用BIO-RADChemiDocTMXRS+凝胶成像系统检测蛋白质条带。M：分子量标记；泳道1：ACTH-tPAst-ALB-pET21a质粒转化菌株未诱导表达，泳道2：ACTH-tPAst-ALB-pET21a质粒转化菌株诱导表达后菌体裂解液，泳道3：ACTH-tPAst-ALB-pET21a质粒转化菌株诱导表达后收集到的包涵体的裂解液。箭头所指为ACTH-tPAst-ALB融合蛋白。图10.原核诱导表达的ACTH-tPAst-ALB的Westernblot检测结果。ACTH-tPAst-ALB经SDS-PAGE(12％Tris-Glycine聚丙烯酰胺凝胶)分离后，转印到硝酸纤维素膜，一抗为鼠抗人ACTH抗体，二抗为Alexa488荧光标记羊抗鼠抗体，用TyphoonFLA9500(GEHealhcare)检测蛋白条带荧光强度。M：分子量标记。泳道1：ACTH-tPAst-ALB-pET21a质粒转化菌株未诱导表达，泳道2：ACTH-tPAst-ALB-pET21a质粒转化菌株诱导表达后菌体裂解液，泳道3：ACTH-tPAst-ALB-pET21a质粒转化菌株诱导表达后收集到的包涵体的裂解液。具体实施方式具体实施方式一：本实施方式表达基因重组ACTH-tPAst-ALB融合蛋白，按以下步骤进行：一、根据原核表达体系中的密码子偏好性优化设计ACTHcDNA序列并合成，使其能够在大肠杆菌表达菌株BL21-DE3中高效表达，选用pET21本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.人促皮质素(ACTH)与人血清白蛋白(ALB)的融合蛋白，其特征在于一条多肽链中同时包含ACTH氨基酸序列和ALB氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.人促皮质素(ACTH)与人血清白蛋白(ALB)的融合蛋白，其特征在于一条多肽链中同时包含ACTH氨基酸序列和ALB氨基酸序列。2.权利要求1所描述的ACTH与ALB融合蛋白中的ACTH与ALB通过组织型纤溶酶原激活剂所识别并降解的底物氨基酸序列(tPAst)相连接，tPAst的特征为包含氨基...
【专利技术属性】
技术研发人员：王大勇，黄永林，武新丽，
申请(专利权)人：王大勇，
类型：发明
国别省市：海南,46
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