本发明专利技术属于基因工程领域，本发明专利技术公开提供了一种重组VEGF的大肠杆菌菌株及制备方法。本发明专利技术提供的大肠杆菌菌株BL21(DE3)/VG6，CCTCC NO：M2015497。该工程菌含有重组质粒pET28a-VEGF I-M2-GRP6，质粒上有重组突变VEGF基因，该基因具有SEQ ID NO.1所示的基因序列。BL21(DE3)/VG6菌株经乳糖诱导，可高效表达重组蛋白VEGF I-M2-GRP6。该重组蛋白预期可以提高机体对肿瘤细胞的免疫应答，打破免疫耐受，达到识别和杀灭肿瘤细胞的目的，对于抗肿瘤治疗具有很好的临床应用前景。
【技术实现步骤摘要】
在基因工程领域，本专利技术公开了一种新的融合蛋白重组工程菌及其构建方法，以 及该融合蛋白的纯化。
技术介绍
重组质粒指的是在基因工程的领域，在体外将目的基因和载体结合成一个具有自 我复制能力的DNA分子，继而转化或转染入宿主菌株或细胞，筛选出含目的基因的重组子。 融合蛋白技术是为了获得目标蛋白而进行的有目的性的基因重组和蛋白表达的方法。利用 融合蛋白技术，可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。 肿瘤疫苗按抗原成分的类型可分为肿瘤细胞型疫苗、肿瘤抗原多肽及蛋白疫苗、 DNA疫苗和树突状细胞疫苗等。无论何种类型的肿瘤疫苗，其研制的关键都在于选择合适的 靶抗原和提高免疫原性。 肿瘤细胞会表达肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原，针对这些抗原发展起来的肿瘤 特异性免疫治疗，是肿瘤生物治疗的重要方法。 肿瘤相关抗原（tumor-associatedantigen，TAA):指并非某一种肿瘤所特有，在 其他肿瘤细胞或正常细胞上也存在的抗原分子。正常细胞与肿瘤细胞仅在增殖中有量的差 异，因此称为相关抗原。 血管内皮生长因子（Vascularendothelialgrowthfactor)是最重要的血管内 皮细胞刺激因子，它可与血管内皮细胞相应受体结合，刺激血管内皮细胞的增殖、迀移，诱 导新生血管形成，提高血管通透性，使肿瘤持续生长。大多数肿瘤细胞均高水平表达VEGF， 而正常组织中仅肾、卵巢等少数脏器有较高水平的表达，因此VEGF是抗肿瘤血管治疗理想 的靶部位。VEGFm突变体I是本实验室用破伤风毒素两个强T辅助表位618-627和831-838 替换hVEGF121的1-8和115-121两个肽段。结果说明在保持半胱氨酸结原有二聚体结构的 前提下，破伤风毒素两个强T辅助表位hVEGF非关键残基置换后，可有效提高VEGF的免疫 原性。 胃泌素释放肽（gastrin-releasingpeptide，GRP)是哺乳动物中的娃皮素同系 物，为一种胃肠道神经激素，含有27个氨基酸，具有生长因子样作用。通过自分泌或旁分泌 途径，GRP可以刺激肿瘤细胞的生长，参与肿瘤新生血管的生成，促进肿瘤的转移等。GRP及 其受体在多种肿瘤细胞中存在过表达，在有限的正常组织中有少量的分布，因此GRP及其 受体是肿瘤治疗的理想靶点。GRP的C端7至8个氨基酸就是其抗原表位，因此我们选择 GRP的C端十肽可以完全覆盖GRP的表位。抗原表位多肽重复多次，可以增加抗原表位的剂 量，增加整个抗原的分子量，从而增加抗原表位多肽的免疫原性。 由于单独用VEGF或GRP免疫原性相对较低，本专利技术将VEGFmI-M2基因同GRP基 因连接起来，组建pET28a-VEGF1，2-61^6重组质粒，诱导表达融合蛋白，将其作为疫苗刺激 机体产生主动免疫，打破免疫耐受，产生针对VEGF和GRP特异性肽段的抗体，从而抑制肿 瘤的生长。
技术实现思路
本专利技术公开一种表达重组VEGF融合蛋白的基因工程菌。 本专利技术的一个目的是提供该重组菌的制备方法，方法简便，易于操作。 本专利技术的另一个目的是公开该重组蛋白的纯化方法。 在本专利技术的第一个方面，该大肠杆菌菌株命名为Escherichia coli BL21(DE3)/ VG6:pET28a-VEGF I-M2-GRP6，菌株已提交中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国、武 汉、武汉大学。保藏日期：2015年8月21日，保藏编号为CCTCC N0:M2015497,分类命名为 Escherichia coli BL21(DE3)/VG6,其细胞中含有重组质粒pET28a-VEGF I-M2-GRP6,质粒中 含有SEQ ID NO. 1所示的重组突变VEGF基因序列。 在本专利技术的第二个方面，提供了该重组质粒的制备方法，其技术路线详述如下： 1.重组质粒pET28a-VEGF I-M2-GRP6及相应基因工程菌的构建 根据本实验室已有的关于重组质粒pET28a-HSP65-GRPf^P pET28a-VEGF I-M2的序 列信息，利用引物设计软件Primer5和oligo7来设计上游引物VI、V2和下游引物Gl、 G2。上游引物VI中引入NcoI，NheI酶切位点以及DPTGG连接肽序列。采用PCR技术从 pET28a-VEGF I-M2质粒中克隆得到基因VEGF I-M2-DP TGG，以及从pET28a-HSP65-GRP6质 粒中克隆得到GRP6基因。通过酶切、酶连和转化技术将PCR的产物VEGF I-M 2-DPTGG插入 pET-28a质粒载体的相应酶切位点中，再将GRP6基因转入刚转化成功的质粒中组成重组质 粒pET28a-VEGF I-M2-GRP6，将重组质粒转化大肠杆菌E.coliBL21获得需要的重组基因的 工程菌。 2.融合蛋白的诱导表达 将重组工程菌进行活化，接种至含卡那霉素的LB培养基中震荡培养过夜，按 1 : 100转接于新鲜LB培养液中，37°C培养至A600值为0. 6-0. 8时，加入乳糖（终浓度 7mM)进行诱导表达，7h后离心收取菌体沉淀，进行12%SDS-PAGE分析，观察目的蛋白条带 位置和表达量。 3.融合蛋白的分离纯化 收集菌体，每克湿菌体加入10mL菌体裂解缓冲液溶解，再进行超声裂解操作，充 分裂解菌体；离心收集沉淀。将沉淀先用包涵体洗涤液A溶解，室温磁力搅拌30min，离 心取沉淀；再分别用包涵体洗涤液B和双蒸水溶解，重复上述洗涤步骤，去除部分杂蛋白 和核酸。将沉淀加入包涵体裂解液，4°C搅拌过夜溶解，离心收集上清。将上清用梯度复 性法进行复性，最后用层析缓冲液于4°C充分透析，离心弃沉淀，上清液过阴离子交换柱 DEAE-cellulose做进一步纯化，用浓度梯度为0-1MNaCl层析缓冲液梯度洗脱，收集洗脱 峰，检测合并目的蛋白峰组分，对蒸馏水充分透析后冻干保存。【附图说明】 图1重组质粒构建原理示意图。 图2 1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物VEGF121I-M2_DPTGG基因的结果。 Lanel :Protein Marker，Lane2 :VEGF121I_M2-DPTGG基因 图3 1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物GRP6基因的结果。Lanel:ProteinMarker，Lane2 :GRP6基因 图4携带VEGF121I-M2-DPTGG基因的pET28a质粒正向测序图 图5 1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物VEGF121I-M2-GRP6基因的结果。Lanel:ProteinMarker，Lane2 :VEGF121I_M2-GRP6基因 图6重组质粒的基因正向测序图。 图7 15%SDS-PAGE电泳检测重组菌经乳糖诱导表达融合蛋白的诱导曲线。Lanel:ProteinMarker，Lane2 :诱导前的全菌蛋白样品，Lane3_10 :诱导后l_8h 每个小时的全菌蛋白样品 图8 15%SDS-PAGE电泳检测融合蛋白破碎后图。Lanel:诱导前全菌蛋白，Lane2 :诱导后6h全菌蛋白，Lane3 :菌体离心后上清， Lane4 :菌体离心后沉淀，Lane5 :超声破碎后取样，Lane6 :超声破碎后离心上清，Lane7本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种生产重组蛋白VEGF I‑M2‑GRP6的大肠杆菌菌株，其特征在于大肠杆菌菌株Escherichia coli.BL21(DE3)/VG6，保藏编号：CCTCC NO：M2015497。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曹荣月，俞敏霞，李曼曼，马云菲，张昕黎，袁玉婷，苗梓韬，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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