5-羟色氨酸的前体定向生物合成制造技术

本发明专利技术提供了有用于在微生物细胞中生产5-羟色氨酸(5-HTP)的化合物、组合物、非天然存在的生物、以及方法。一种包含至少一种微生物细胞的微生物系统被基因工程化以表达非天然存在的生物合成途径的全部或一部份，该至少一种微生物细胞是例如细菌细胞或者酵母细胞，该生物合成途径催化简单碳源例如葡萄糖转化为5-HTP。本发明专利技术可导致5-HTP的效价改善并且允许低成本、大规模生产。制造和使用这些基因工程化细胞的方法也被包含在本发明专利技术中。

【技术实现步骤摘要】
【专利说明】5-羟色氨酸的前体定向生物合成 本申请要求2014年9月2日提交的美国临时申请序列号62/044,667的权益，该 申请通过引用以其全文结合在此。
技术介绍
5-羟色氨酸（5-HTP)是一种天然的非蛋白原氨基酸，其充当神经递质血清素的直 接生物合成前体。中枢神经系统（CNS)中血清素不足被认为是抑郁症的一个重要的生理因 素。5-HTP已被证明对于治疗各种病况是有效的，包括抑郁症、失眠症、慢性头痛以及与肥胖 症有关的暴食。同时，它的副作用相对较少。5-HTP的治疗效果应归于其提高血清素在大 脑中合成的能力。5-HTP通过口服剂量很好地被吸收并且可以很容易地穿越血脑屏障（索 尔，1998,《替代医学评论》，3, 271-280)。在大部分欧洲国家，5-HTP是一种用于多种治疗目 的的常用处方药，而在北美市场，它被作为一种"非处方"膳食补充剂出售。 目前，5-HTP通过从加纳籽中提取而获得，其是一种生长在非洲的木本的攀缘灌 木。该原材料的供应依赖于季节和地区，一直很大地限制其有成本效益的生产和广泛的临 床应用。此外，来自加纳籽的5-HTP被一种称为顶峰X的化合物污染，导致美国农业部暂时 地令该补充剂在美国下架。目前，5-HTP的大宗批发价格在400到1000美元/kg之间变动。 然而，尽管当前的生产成本高而且供应有限，5-HTP的全球市场仍然约50, OOOkg (整批价值 2-5千万美元）。 专利技术概述 本专利技术提供了新型的代谢改造微生物细胞，以及使用所述细胞用于从简单碳源 (例如，葡萄糖）进行微生物生产5-羟色氨酸（5-HTP)的方法。更特别地，本专利技术提供了新 型的微生物系统，其包括一种或多种基因工程化以表达全部或一部份用于5-HTP生产的新 型代谢途径的微生物细胞。该新型代谢途径使用一种或多种具有宽松底物选择性的酶，其 被有利地利用于该新型代谢途径中以催化涉及一种或多种非天然底物的反应。整个生物合 成途径可以被整合到单个微生物细胞；然而，已经发现当使用两种微生物细胞时5-HTP的 生产提高了，其中第一细胞整合该途径的上游部份，生产5-羟基邻氨基苯甲酸（5-HAA)中 间体，而第二细胞整合该途径的下游部份，生产5-HTP终产物。制造和使用该基因工程化细 胞的方法也被包含在本专利技术中，包括但并不仅限于制造5-HTP或其任一前体（例如，5-HAA) 的方法。这类方法可以包含在一定的条件下培养一种或多种在此描述的基因工程化细胞并 持续足以生产5-HTP或其任一前体的时间，并且可任选地分离产物。 该方法可以进一步包含将5-HTP纳入一种食物产品中。该食物产品可以适合人类 食用和/或可以是动物饲料或饮料。该方法可以包含包装5-HTP或供出售的食物产品并 且可任选地向作为食品添加剂、食品补充剂或营养食品的5-HTP或食物产品提供使用说明 书。在一个实施例中，该食品添加剂、食品补充剂或营养食品被包装作为动物饲料或饮料使 用。 词语"优选的"和"优选地"指可以在某些环境下提供某些益处的本专利技术实施例。 然而，在相同或其他环境下，其他实施例也可以是优选的。另外，对一个或多个优选实施例 的描述不暗示其他实施例是无用的，并且不意图从本专利技术的范围中排除其他实施例。 术语"包含"及其变体，在这些术语在本说明书和权利要求书中出现的情况下，不 具有限制性含义。 除非另外说明，"一个（a) "、"一种（an)"、"该（the)"、和"至少一个（at least one) "可互换地使用并且意指一个或多于一个。另外在本文中，借助端点对数值范围进行的描述包括隶属该范围的全部数字（例 如，1 至 5 包括 1、1· 5、2、2· 75、3、3· 80、4、5 等）。 对于本文中披露的、包括分离步骤的任何方法，这些步骤可以按任何可行顺序实 施。并且，如果适宜，两个或更多个步骤的任何组合可以同时实施。 本专利技术的以上概述不意在描述本专利技术的每个所披露的实施例或每一个实施方式。 以下本说明书更加具体地示例了示意性实施例。贯穿本申请，在几个地方中，通过一系列实 例提供指导，这些实例能以多种组合形式使用。在每种情况下，所述系列仅作为代表性群组 发挥作用并且不应当解释为排他性系列。 缩略语： AA 邻氨基苯甲酸 5-HAA 5-羟基邻氨基苯甲酸 5-HI 5-羟基吲哚 TP或Trp色氨酸 5-HTP 5-轻色氨酸 SA 水杨酸 GA 龙胆酸 附图简述 图IA示出了一种新型的5-HTP生物合成途径的实例。TrpEftoG :邻氨基苯甲酸合 酶（抗反馈突变体）；SalABCD :水杨酸5-羟化酶；TrpDCA和TrpB :大肠杆菌原生色氨酸生 物合成酶。虚线示出了经由色氨酸生物合成酶的作用朝向色氨酸可能的碳分流。大肠杆菌 BWl是整合完整生物合成途径的示例性菌株。 图IB示出了一种新型的5-HTP生物合成途径的另一实例，其分为上游和下游部 份。TrpE ftoG :邻氨基苯甲酸合酶（抗反馈突变体）；SalABCD :水杨酸5-羟化酶；TrpDCA和 TrpB :大肠杆菌原生色氨酸生物合成酶。在一个双细胞系统中，大肠杆菌BW3是整合生物合 成途径上游部份的示例性菌株，其出产5-羟基邻氨基苯甲酸（5-HAA);大肠杆菌BW2是整 合生物合成途径下游部份的示例性菌株。 图IA和IB中所示的步骤1，2和3代表用于如实例1所描述的逆向工程化5-HTP 的微生物合成的步骤，其中步骤1代表最下游的步骤而步骤3代表最上游的步骤。 图IC示出了一种新型的5-HTP生物合成途径的另外的实例，其分为上游和下游部 份，其中该途径使用显示宽松底物选择性的水杨酸5-羟化酶和色氨酸生物合成活性。 图2A示出了在TrpDCBA (上图）催化下邻氨基苯甲酸（AA)转化为色氨酸（TP)以 及同样在TrpDCBA(下图）催化下类似的5-羟基邻氨基苯甲酸（5-HAA)转化为5-羟色氨 酸（5-HTP)。 图2B示出了 TrpDCBA对于天然底物AA (黑色）以及非天然底物5-HAA (灰色）的 体内测定。含有质粒pCS-trpDCBA的菌株BW2被用于体内测定。每一反应的产物显示在各 柱状图的顶部。Trp:色氨酸。 图3A示出了使用含有低拷贝数质粒pSA-trpDCBA的菌株BW2将5-HAA生物转化 为5-HTP。在Oh和IOh将5-HAA(600mg/L)加入培养物。每四小时提取样本并通过HPLC进 行分析。 图3B示出了使用含有中拷贝数质粒pCS-trpDCBA的菌株BW2将5-HAA生物转化 为5-HTP。在Oh和IOh将5-HAA(600mg/L)加入培养物。每四小时提取样本并通过HPLC进 行分析。 图4A示出了在SalAB⑶（上图）催化下水杨酸向龙胆酸（GA)的原生细菌转化；在 SalAB⑶催化下AA转化为5-HAA，因为水杨酸（2-羟基苯甲酸）和AA(2-氨基苯甲酸）具 有相似的分子结构（中图）；以及在邻氨基苯甲酰-辅酶A合成酶（PqsA)和水杨酰-辅酶 A 5-羟化酶（SdgC)连续作用（下图）催化下AA转化为5-HAA。 图4B示出了邻氨基苯甲酸5-羟化酶的体内测定。菌株BW3被用作宿主。所使用 的质粒显示在各柱状图的下面。每一反应的产物显示在各柱状图的顶部本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于生产5‑羟色氨酸(5‑HTP)的微生物系统，该系统包括多个基因工程化细胞，这些细胞包括：一种第一基因工程化细胞，包括(i)至少一种莽草酸途径酶，(ii)至少一种具有邻氨基苯甲酸合酶活性的酶，以及(iii)至少一种具有水杨酸5‑羟化酶(S5H)活性的酶，该酶进一步具有对非天然邻氨基苯甲酸(AA)底物的活性；以及一种第二基因工程化细胞，包括至少一种具有色氨酸生物合成活性的酶，其中该酶催化邻氨基苯甲酸(AA)转化为色氨酸并且进一步具有对非天然5‑羟基邻氨基苯甲酸(5‑HAA)底物的活性。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：闫亚军，孙新晓，
申请(专利权)人：乔治亚大学研究基金公司，
类型：发明
国别省市：美国;US