【技术实现步骤摘要】
基因重组人胶原蛋白融合肽段及其制备方法和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及到基因重组人胶原蛋白融合肽段。技术背景胶原蛋白(colhgen)是广泛分布于动物结缔组织的一组蛋白质家族，也是体内含 量最多的一种蛋白质，约占蛋白质总量的25-33%，其对维护细胞、组织、器官的正常生 理功能和损伤修复有重要作用。胶原蛋白作为天然的生物资源，具有合成高分子材料无 法比拟的生物相容性和生物可降解性，可广泛应用在医药、化妆品等工业中，它能保持 血管壁弹性、防止栓塞、提高软骨以及韧带的润滑、减轻关节僵硬等，其在治疗真皮损 伤或缺陷、美容整形、改善睡眠、增强机体免疫力等方面的作用已获得共识，同时它们 含有大量极性基团，和甘氨酸等天然保湿因子，且有阻止皮肤中的酪氨酸转化为黑色素 的作用，故胶原蛋白有纯天然保湿、美白、防皱、祛斑等作用。另外，胶原蛋白也在食 品、保健品和饲料添加剂等行业得到应用。胶原蛋白最普遍的结构特征是三螺旋结构，由3条α肽链组成，每一条胶原链 都是左手螺旋构型，3条左手螺旋链相互缠绕成右手螺旋结构，形成胶原蛋白独特的三重 螺旋结构，使其分子结构相对稳定。一...
【技术保护点】
一种基因重组人胶原蛋白融合肽段，其特征在于：它的全长为８３９个氨基酸，其氮端为Ⅲ型人胶原蛋白９０８－１１３７位肽段共２２９个氨基酸，碳端为Ⅰ型人胶原蛋白４９７－１１０４位肽段共６０８个氨基酸，两肽段之间用谷氨酸和苯丙氨酸链接；该基因重组人胶原蛋白融合肽段的氨基酸序列如下：ＡＧＮＴＧＡＰＧＳＰ ＧＶＳＧＰＫＧＤＡＧ ＱＰＧＥＫＧＳＰＧＡ ＱＧＰＰＧＡＰＧＰＬ ＧＩＡＧＩＴＧＡＲＧＬＡＧＰＰＧＭＰＧＰ ＲＧＳＰＧＰＱＧＶＫ ＧＥＳＧＫＰＧＡＮＧ ＬＳＧＥＲＧＰＰＧＰ ＱＧＬＰＧＬＡＧＴＡ １００ＧＥＰＧＲＤＧＮＰＧ ＳＤＧＬＰＧＲＤＧＳ ＰＧＧＫＧＤＲＧＥＮ ＧＳＰＧＡＰＧＡＰ...
【技术特征摘要】
1.一种基因重组人胶原蛋白融合肽段，其特征在于它的全长为839个氨基酸， 其氮端为III型人胶原蛋白908-1137位肽段共229个氨基酸，碳端为I型人胶原蛋白 497-1104位肽段共608个氨基酸，两肽段之间用谷氨酸和苯丙氨酸链接；该基因重组人 胶原蛋白融合肽段的氨基酸序列如下AGNTGAPGSP GVSGPKGDAG QPGEKGSPGA QGPPGAPGPL GIAGITGARG LAGPPGMPGP RGSPGPQGVK GESGKPGANG LSGERGPPGP QGLPGLAGTA 100 GEPGRDGNPG SDGLPGRDGS PGGKGDRGEN GSPGAPGAPG HPGPPGPVGP AGKSGDRGES GPAGPAGAPG PAGSRGAPGP QGPRGDKGET GERGAAGIKG 200 HRGFPGNPGA PGSPGPAGQQ GAIGSPGPAE FGADGVAGPK GPAGERGSPG PAGPKGSPGE AGRPGEAGLP GAKGLTGSPG SPGPDGKTGP PGPAGQDGRP 300 GPPGPPGARG QAGVMGFPGP KGAAGEPGKA GERGVPGPPG AVGPAGKDGE AGAQGPPGPA GPAGERGEQG PAGSPGFQGL PGPAGPPGEA GKPGEQGVPG 400 DLGAPGPSGA RGERGFPGER GVQGPPGPAG PRGANGAPGN DGAKGDAGAP GAPGSQGAPG LQGMPGERGA AGLPGPKGDR GDAGPKGADG SPGKDGVRGL 500 TGPIGPPGPA GAPGDKGESG PSGPAGPTGA RGAPGDRGEP GPPGPAGFAG PPGADGQPGA KGEPGDAGAK GDAGPPGPAG PAGPPGPIGN VGAPGAKGAR 600 GSAGPPGATG FPGAAGRVGP PGPSGNAGPP GPPGPAGKEG GKGPRGETGP AGRPGEVGPP GPPGPAGEKG SPGADGPAGA PGTPGPQGIA GQRGVVGLPG 700 QRGERGFPGL PGPSGEPGKQ GPSGASGERG PPGPMGPPGL AGPPGESGRE GAPGAEGSPG RDGSPGAKGD RGETGPAGPP GAPGAPGAPG PVGPAGKSGD 800 RGETGPAGPA GPVGPVGARG PAGPQGPRGD KGETGEQGD- 8392.—种权利要求1基因重组人胶原蛋白融合肽段的制备方法，其特正在于该方法由下 述步骤组成(1)克隆I型即COLl和III型即COL3人胶原蛋白基因的cDNA 从新鲜人胎盘组织中提取总RNA，以总RNA为模板，反转录得cDNA，设计COLl 禾口 COL3弓丨物，COLl弓丨物序列为 F = CTGGCGCAGATGGTGTTG R = CCACGGTGACCCTTTATGC 产物长度为1849bp ； COL3引物序列为 F = GAATCTGTGAATCATGCCCTAC R = GAAGTCATAATCTCATCGGTGTT 产物长度为3295bp ；以cDNA为模板，进行PCR扩增，提取特异性DNA扩增条带，得COLl和COL3 ； 将COLl和COL3连接于pGM-T载体，转化感受态E.coli DH 5 α，涂布平板，经蓝白斑 筛选，挑选阳性pGMT-COLl和pGMT-COL3克隆，分别接种于LB培养基中，37°C振荡 过夜培养，提取这两种质粒，为下一步做好准备；⑵毕赤酵母重组表达载体pPIC9K-COL3al_COLlal的构建 引物设计COL3al上游引物设计两条，引入pPIC9K自身信号肽序列GAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT,进行两次扩增，各引物序列如下 COLlal引物序列为F = GC GAATTCGGCGCAGATGGTGTTGC,酶切位点 EcoRI R = TG GAATTCTTAGTCGCCCTGTCGCCTG,酶切位点 EcoRI 产物长度1843bp ； COL3al引物序列为Fl = AGGCTGAAGCTGCGGGTAACACTGF2 = TCT CTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT,酶切位点 Xho IR TT GAATTCTGCAGGTCCTGG,酶切位点 EcoRI产物长度722bp ；pPIC9k-COLl鉴定引物序列为F = GCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAR = TCGCTCTCCAGCCTTGCCG产物长度1155bp ；分别以pGMT-COLl和pGMT-COL3质粒为模板，进行PCR扩增，提取产物，得 C03al和COlal，双酶切C03al和pPIC9K,以T4联接酶处理，得pPIC9K_C03al ；单 酶切COlal和pPIC9K-C03al，以T4联接酶处理，得pPIC9K-C03al_C01al ；转化感受^ E.coli DH 5 α ,涂布平板，经蓝白斑筛选，挑选阳性克隆，接种于LB培养基中，37°C 振荡过夜培养，提取质粒，为下一步做好准备；(3)基因重组人胶原蛋白融合肽段毕赤酵母基因工程菌SMD1168-COL3al_COLlal 的构建抽提pPIC9K-COL3al_COLlal质粒并线性化，制备毕赤酵母SMD1168感受态细 胞，电击转化，以G418梯度法挑选高拷贝阳性克隆，得基因重组人胶原蛋白融合肽段毕 赤酵母基因工程菌SMD1168-COL3al_COLlal，其目标蛋白的基因序列如下·1 CTCGAGAAAA GAGAGGCTGAAGCTGCGGGTAACACTGGTG CTCCTGGCAG CCCTGGAGTG·61 TCTGGACCAA AAGGTGATGCTGGCCAACCA GGAGAGAAGG GATCGCCTGG TGCCCAGGGC·121 CCACCAGGAG CTCCAGGCCC ACTTGGGATT GCTGGGATCA CTGGAGCACG GGGTCTTGCA·181 GGACCACCAG GCATGCCAGGTCCTAGGGGA AGCCCTGGCC CTCAGGGTGT CAAGGGTGAA·241 AGTGGGAAAC CAGGAGCTAA CGGTCTCAGT GGAGAACGTG GTCCCCCTGG ACCCCAGGGT·301 CTTCCTGGTCTGGCTGGTACAGCTGGTGAA CCTGGAAGAG ATGGAAACCC TGGATCAGAT·361 GGTCTTCCAG GCCGAGATGG ATCTCCTGGT GGCAAGGGTG ATCGTGGTGA AAATGGCTCT·421 CCTGGTGCCC CTGGCGCTCC TGGTCATCCA GGCCCACCTGGTCCTGTCGG TCCAGCTGGA·481 AAGAGTGGTG ACAGAGGAGA AAGTGGCCCT GCTGGCCCTG CTGGTGCTCC CGGTCCTGCT·541 GGTTCCCGAG GTGCTCCTGGTCCTCAAGGC CCACGTGGTG ACAAAGGTGA AACAGGTGAA·601 CGTGGAGCTG CTGGCATCAA AGGACATCGA GGATTCCCTG GTAATCCAGG TGCCCCAGGT·661 TCTCCAGGCC CTGCTGGTCA GCAGGGTGCA ATCGGCAGTC CAGGACCTGC AGAAT...
【专利技术属性】
技术研发人员：张凤龙，侯曾淼，赵金礼，
申请(专利权)人：西安华澳丽康生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]
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