基因重组人胶原蛋白制造技术

一种由真核菌生产的人源化基因重组人胶原蛋白，全长474个氨基酸，由两段完全相同的人Ⅲ型胶原片段串联而成，C端连接6个组氨酸残基作为特异性亲和纯化标记。基因重组人胶原蛋白性能优于动物胶原蛋白、原核工程菌重组胶原；带有特异性亲和纯化标记，易于得到高纯度产品。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种重组胶原蛋白及其生产方法。
技术介绍
胶原蛋白是一种生物高分子物质，是维持肌肤和组织器官的形态和结构，也是修复各损伤组织的重要物质。主要存在于人和动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带和血管中，是结缔组织中重要的结构蛋白质，起着支撑器官、保护机体的功能。胶原蛋白对维护细胞、组织、器官的正常生理功能和损伤修复有重要作用。胶原蛋白可以给予含有胶原蛋白的皮肤层所必需的养分，使皮肤中的胶原蛋白活性加强，保持角质层水分以及纤维结构的完整性，改善皮肤细胞生存环境和促进皮肤组织的新陈代谢，增加循环，达到滋润皮肤延缓老化，美容，消皱，养发的目的。生产胶原蛋白的传统方法是利用酸、碱或酶来处理动物组织(猪皮、牛皮、驴皮、鱼皮/鳞等)，从中提取胶原蛋白。这些方法虽然成本低廉、回收率较高，但是制取的胶原蛋白均为分子量很小且长度不等的混合胶原蛋白肽段，俗称明胶，很难起到保湿、滋养的效果；提取工艺简单粗放，产物纯度不佳，常有异味；动物来源，无法摆脱生物安全隐患，极大的限制了传统胶原在化妆品、食品、药品等各类产品中的广泛应用；加工提取时产生巨量废水严重伤害环境；技术门椹低，原料来源不易控制，造成皮鞋奶、毒胶囊横行，食品、药品安全隐患严重。为了解释传统动物胶原的一系列问题，许多学者开始着手应用生物技术来生产重组胶原，因微生物培养的种种便利，利用重组微生物生产胶原逐渐成为主流。产业化生产的，如范代娣应用大肠杆菌高密度发酵培养生产的重组类人胶原蛋白，并已成功应用到化妆品领域。但是细菌表达体系具有内毒素、热原等生物安全问题，使得产品的生产、检测成本高企，并存在隐患；表达的蛋白以包涵体形式存在细菌细胞内，产物纯化困难、回收率受限制；另外原核表达系统比较低级，不能完成表达产物的翻译后加工修饰，使产物不具有生物活性。因此，越来越多的学者开始利用真核微生物生产重组胶原:张凤龙等利用毕赤酵母合成几乎完全人源性的重组胶原，应用于化妆品。但其纯化方法仅采用了超滤、凝胶过滤、离子交换等传统非特异性的大分子分离技术，纯度不够高，杂蛋白和部分降解蛋白无法彻度去除，满足不了微创美容、整形美容对纯度的更高要求。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有重组胶原及其制备技术的不足，提供一种真核工程菌生产的完全人源化的重组胶原，其性能远优于动物胶原蛋白、原核微生物重组胶原；同时带有特异性亲和纯化标记，易于得到高纯度产品。基因重组人胶原蛋白全长474个氨基酸，由两段完全相同的人III型胶原片段串联而成，C末端连接6个组氨酸残基，其序列(SEQ ID N0.1)如下:AGNTGAPGSP GVSGPKGDAG QPGEKGSPGA QGPPGAPGPL GIAGITGARG 50 LAGPPGMPGPRGSPGPQGVK GESGKPGANG LSGERGPPGP QGLPGLAGTA 100 GEPGRDGNPG SDGLPGRDGSPGGKGDRGEN GSPGAPGAPG HPGPPGPVGP 150 AGKS⑶RGES GPAGPAGAPG PAGSRGAPGPQGPRGDKGET GERGAAGIKG 200 HRGFPGNPGA PGSPGPAGQQ GAIGSPGPAE FTAGNTGAPGSPGVSGPKGD 250 AGQPGEKGSP GAQGPPGAPG PLGIAGITGA RGLAGPPGMP GPRGSPGPQG300 VKGESGKPGA NGLSGERGPP GPQGLPGLAG TAGEPGRDGN PGSDGLPGRD 350GSPGGKGDRG ENGSPGAPGA PGHPGPPGPV GPAGKS⑶RG ESGPAGPAGA 400 PGPAGSRGAPGPQGPRGDKG ETGERGAAGI KGHRGFPGNP GAPGSPGPAG 450 QQGAIGSPGP ADHHHHHHTGLARF474 蛋白为单链结构，其中I 229和233 461为相同的III型胶原肽段，两段人III型胶原蛋白片段之间有EFT连接，233 461的人III型胶蛋白原片段后采用DHHHHHHTGLARF进行修饰，其中463 468为亲和纯化标记6His。 生产上述蛋白的基因重组工程菌及蛋白制备方法由下述步骤组成: (一)、重组表达载体的构建 从人新鲜胎盘中提取总RNA，反转录为cDNA，根据GenBank III型人胶原蛋白C0L3A1基因序列，设计 PCR 扩增引物 F (SEQ ID N0.2)、R (SEQ ID N0.3):F: GAATCTGTGAATCATGCCCTACR: GAAGTCATAATCTCAT CGGTGTT 以cDNA为模版PCR扩增C0L3A1基因，产物长度为3295bp。回收特异性产物连接于pGM-T 载体，得到质粒 pGM-T- C0L3A1 ； 依照《分子克隆实验指南》中多重PCR的方法，以pGM-T- C0L3A1质粒为模板，使用引物F1、F2、R进行多重PCR扩增，得到产物为722bp的产物C0L3，引物为:(SEQ ID N0.4) Fl:AGGCTGAAGCTGCGGGTAACACTG(SEQ ID N0.5) F2:TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT(SEQ ID N0.6) R: TTGAATTCTGCAGGTCCTGG 将产物C0L3和载体pPIC9K分别做EcoR 1、Xho I双酶切，并经T4 DNA连接酶连接成为 pPIC9K-C0L3 ； 以质粒pPIC9K-C0L3为模板，设计引物，再次扩增C0L3，同时添加6His标记。弓丨物为:(SEQ ID N0.7) F:CCCGAATTCACTGCGGGTAACACTGGTGC(SEQ ID N0.8) R:AAAACCGGTGTGGTGGTGGTGGTGGTGATCTGCAGGTCCTGGACTG将二次扩增产物C0L3-6His和质粒pPIC9K-C0L3分别进行EcoR 1、Age I双酶切，并经T4 DNA连接酶连接成为pPIC9K-C0L3-C0L3-6His。目标蛋白的基因序列如下: I GCGGGTAACA CTGGTGCTCC TGGCAGCCCT GGAGTGTCTG GACCAAAAGG 51 TGATGCTGGC CAACCAGGAG AGAAGGGATC GCCTGGTGCC CAGGGCCCAC 101 CAGGAGCTCC AGGCCCACTT GGGATTGCTG GGATCACTGG AGCACGGGGT 151 CTTGCAGGAC CACCAGGCAT GCCAGGTCCT AGGGGAAGCC CTGGCCCTCA 201 GGGTGTCAAG GGTGAAAGTG GGAAACCAGG AGCTAACGGT CTCAGTGGAG权利要求1.一种人源化基因重组胶原蛋白，其特征是序列如下:蛋白全长474个氨基酸，其中I 229和233 461为相同的人III型胶蛋白原片段，两段人III型胶原蛋白片段之间有EFT连接，233 461的人III型胶蛋白原片段后采用DHHHHHHTGLARF进本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人源化基因重组胶原蛋白，其特征是序列如下：蛋白全长474个氨基酸，其中1～229和233～461为相同的人Ⅲ型胶蛋白原片段，两段人Ⅲ型胶原蛋白片段之间有EFT连接，233～461的人Ⅲ型胶蛋白原片段后采用DHHHHHHTGLARF进行修饰；其氨基酸序列如下：（SEQ ID NO.1）AGNTGAPGSP　GVSGPKGDAG　QPGEKGSPGA　QGPPGAPGPL　GIAGITGARG　50 LAGPPGMPGP　RGSPGPQGVK　GESGKPGANG LSGERGPPGP　QGLPGLAGTA　100 GEPGRDGNPG　SDGLPGRDGS　PGGKGDRGEN　GSPGAPGAPG　HPGPPGPVGP　150 AGKSGDRGES　GPAGPAGAPG　PAGSRGAPGP QGPRGDKGET　GERGAAGIKG　200 HRGFPGNPGA　PGSPGPAGQQ　GAIGSPGPAE   FTAGNTGAPG　SPGVSGPKGD　250 AGQPGEKGSP　GAQGPPGAPG　PLGIAGITGA   RGLAGPPGMP　GPRGSPGPQG     300VKGESGKPGA　NGLSGERGPP　GPQGLPGLAG　TAGEPGRDGN　PGSDGLPGRD　350 GSPGGKGDRG　ENGSPGAPGA　PGHPGPPGPV　GPAGKSGDRG　ESGPAGPAGA　400 PGPAGSRGAP　GPQGPRGDKG　ETGERGAAGI　KGHRGFPGNP　GAPGSPGPAG 　450 QQGAIGSPGP　ADHHHHHHTG　LARF　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 474。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：梁亮，
申请(专利权)人：西安益力欣生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61