本发明专利技术一种重组人胰岛素的制备方法涉及蛋白质多肽类药物领域。本发明专利技术所要解决的技术问题是提供一种大肠杆菌表达重组人胰岛素的制备方法以克服现有技术中存在的使用有毒有害物质ＣＮＢｒ、生产工艺复杂之技术缺陷。本发明专利技术的重组人胰岛素的制备方法包括菌体破碎、包涵体溶解、胰岛素原磺化、纯化胰岛素原、胰岛素原复性和酶切转化等步骤，特征在于在包涵体溶解的过程中将胰岛素原的－ＳＨ转化为－ＳＳＯ↓［３］↑［－］，经过阳离子纯化该磺化的胰岛素原、还原复性、酶切转化再经过阴离子交换层析纯化获得人胰岛素。本发明专利技术的重组人胰岛素的制备方法不使用ＣＮＢｒ，工艺简单、人胰岛素的收率和纯度高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及蛋白质多肽类药物领域，尤其涉及。
技术介绍
糖尿病是仅次于心血管和肿瘤的第三大致死疾病，现今世界上已有2亿糖 尿病患者，而且每年新增约600万新病例，每年死于糖尿病及相关并发症者达 到320万(2006年6月美国糖尿病年会报告)。胰岛素是治疗糖尿病的特效药， 尤其是在治疗I型糖尿病和II型糖尿病晚期患者时，还没有其它药物可以代替。 胰岛素在临床上已经成功地应用了80多年。随着生物技术的发展，重组人胰岛 素已经逐渐取代了动物内脏提取的动物胰岛素。随着对糖尿病患者人群的扩大 和胰岛素用药方式的多样化(口服给药、肺部给药和口腔喷雾给药等)，胰岛素 的用量迅速增加，因此，提高胰岛素的产量，降低胰岛素的生产成本，满足广 大糖尿病患者用药的需求，不仅具有重要的经济意义，而且具有重要的社会意 义。目前应用大肠杆菌表达重组人胰岛素生产方式主要要包括三种方式 一种是 美国Eli Lilly and Company(礼来公司)1982年采用的重组大肠杆菌分别表达胰 岛素的A链和B链，表达产物经氰化溴(bromine cyanide, CNBr，中文别名 溴化氰)切下多余片段后，得到的A链和B链经纯化后再进行复性，最后得到 有活性的重组人胰岛素。由于A链和B链共存在6个半胱氨酸，复性率只有 10%左右，所以采用这条工艺路线生产胰岛素的成本高，每克成本在100美元 以上。第二种也是美国Eli Lilly and Company建立的，目前仍然采用此工艺生 产年产量达十几吨的重组人胰岛素。将含有A链、B链和C肽的胰岛素原在大肠杆菌中表达，在这种人胰岛素原表达工艺中，由于C肽的存在，胰岛素原能 形成良好的空间构象，三对二硫键的正确配对率也相应提高，折叠率高达80% 以上。虽然这条工艺路线并不比A、 B链分别表达法更为简捷，在去除肽链过程中使用了 CNBr，而且还要使用胰蛋白酶和羧肽酶B两种高纯度的酶制剂， 但理想的折叠率在很大程度上弥补了工艺繁琐的缺陷，使得每克最终产品的成 本仅50美元。第三种方式是采用丹麦NovoNordisk公司(诺和诺德公司)所采 用的A、 B链同时表达的方法，在A链前端和A、 B链中间均有甲硫氨酸，表 达后纯化的产物经CNBr处理，得到A链和B链，再经过复性和纯化得到有活 性的重组人胰岛素，这种方式与第一种方式同样存在复性率低和生产成本高的 问题。现有重组人胰岛素的生产方法中存在在生产过程中使用剧毒CNBr之技术 缺陷。通过吸入、食入、经皮吸收，对人体健康造成极大危害，例如吸入后引 起头痛、头晕、恶心、呕吐、虚弱、惊厥、昏迷、咳嗽、呼吸困难，重者发生 肺水肿，可致死；对眼和皮肤有强烈刺激性。其危险特性在于与水或水蒸气 接触会放出剧毒、易燃和腐蚀性的溴化氢和氰化氢气体。有不纯物质存在时能 很快引起分解，并引起爆炸。因而操作条件苛刻，对环境保护措施要求高。另 外简化重组人胰岛素的生产工艺、提高收率和降低生产成本不但可以满足临床 对胰岛素用药量的需求，也可以满足越来越多中低收入患者和发展中国家糖尿 病患者的对重组人胰岛素价格的要求。
技术实现思路
专利技术人经过广泛而深入的研究，对大肠杆菌表达重组人胰岛素的制造方法 进行了改进，经过广泛试验改进了胰岛素原包涵体的溶解、包涵体纯化和胰岛素原的酶切转化条件。最终实现了避免使用CNBr，简化重组人胰岛素的生产工艺并提高了重组人胰岛素的收率。因而，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种大肠杆菌表达重组人胰岛素的制备方法以克服现有技术中存在的使用有毒有害物质CNBr、生产工艺复杂之技 术缺陷。本专利技术的，包括如下步骤(a) 表达重组人胰岛素原的大肠杆菌菌体破碎，收集包涵体；(b) 洗涤包涵体，然后溶解包涵体使人胰岛素原磺化；(c) 用阳离子交换法纯化步骤(b)的人胰岛素原；(d) 纯化的人胰岛素原复性，用胰蛋白酶和羧肽酶B酶切转化；(e) 用阴离子交换法纯化步骤(d)的酶切产物；和(f) 用本领域常用的方法结晶人胰岛素，其特征在于，步骤(b)所述的人胰岛素原磺化是通过将人胰岛素原中的胱氨酸 残基的巯基(一SH)取代为一ssor实现的。优选地， ，其特征在于，溶解包涵体的条件是:终浓度为50mM的EDTA、终浓度50mM的Tris-HCl、终浓度为6M的尿素、终 浓度为0.2M的亚硫酸钠、终浓度为0.1M的连四硫酸钠、pH9.0-10.5。更优选地， ，其特征在于，经阳离子交换法纯 化的人胰岛素原S —磺酸盐复性的条件是蛋白浓度0.5 1.0mg/mL。进一步优选的重组人胰岛素的制备方法，其特征在于人胰岛素原复性的条件是缓冲液为含1M尿素的50mM的Gly缓冲液(pH11.5)，通氮气，巯基乙醇的浓度与胰岛 素原的摩尔比为1: 3 6。所说的重组人胰岛素原的结构与天然人胰岛素原相同或不同，包括完整的人胰岛素的A链和B链，其C链和人胰岛素原相同或不同，例如可以是改短的C 链。重组人胰岛素原还可以包含一段前导的序列。尤其是用本领域技术人员常 用的分子生物学技术设计高等电点(pi)的胰岛素原。步骤(c)和步骤(e)所述的阳离子交换法和阴离子交换法所采用介质可以 是本领域常用的介质，可以通过多种商业途径购得。优选地步骤(c)的阳离子 交换介质采用强阳离子交换介质，如SPSepharoseFF(GE Healthcare),步骤(e) 的阴离子交换介质釆用TEME介质。更优选地步骤(c)的层析条件是将步骤 (b)溶解的包涵体溶液用6M尿素稀释，4。C条件下离心，上清上SP Sepharose FF柱进行层析，用lMNaCl洗柱，再用含3M乙酸钠、1MNaCl的洗脱液平 衡，收集洗脱峰。步骤(e)的阴离子交换法采用本领域技术人员熟知的方法进 行，或者按照厂家推荐的方法活化阴离子交换介质、进行层析操作。胰岛素结晶的方法在本领域是已知的，例如可以参见CN1390854A公开的方法。本专利技术的重组人胰岛素的制备方法具有如下有益的技术效果本专利技术针对 一种高等电点的胰岛素原，提供一种简便高效的纯化方法，大肠杆菌表达的胰 岛素原包涵体经溶解后，通过阳离子交换柱一步纯化后，纯度可达到95%以上， 纯化后的胰岛素原复性率可达60%以上，复性后再经胰蛋白酶和羧肽酶B酶切， 通过阴离子交换柱纯化后的纯度可达99.0%以上，收率为500mg/100g菌体。再 通过结晶得到的产品与重组人胰岛素标准品的化学结构和生物活性相同。本发 明在整个工艺过程中不使用CNBr等有毒试剂和有机溶剂，工艺简单，快速高效， 所有操作过程均可以在室温或4t:环境下进行，从而大大降低了纯化过程的生产 成本，适合大规模生产重组人胰岛素。 附图说明图1是本专利技术的流程图。图2是表达重组人胰岛素原的大肠杆菌菌体破碎全菌、上清和经洗涤的包涵 体的SDS——PAGE检测结果，泳道1是全菌，泳道3是包涵体。图3是阳离子柱层析纯化磺化胰岛素原目的峰SDS—PAGE检测结果。图4是胰岛素原经胰蛋白酶和羧肽酶B酶切转化后的电泳结果，泳道2系胰 岛素原、泳道3是胰蛋白酶酶切后、4是羧肽酶B酶切后、泳道5是胰岛素标准 品，显示本专利技术的胰岛素和胰岛素标准品具有相同的分子量。图5是酶切产物的阴离子交换层析图谱。图6是胰岛素产物的HPLC检测结果，A本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组人胰岛素的制备方法，包括如下步骤： （ａ）表达重组人胰岛素原的大肠杆菌菌体破碎，收集包涵体； （ｂ）洗涤包涵体，然后溶解包涵体使人胰岛素原磺化； （ｃ）用阳离子交换法纯化步骤（ｂ）的人胰岛素原； （ｄ）纯化的人胰岛素原复性，用胰蛋白酶和羧肽酶Ｂ酶切转化； （ｅ）用阴离子交换法纯化步骤（ｄ）的酶切产物；和 （ｆ）用本领域常用的方法结晶人胰岛素， 其特征在于，步骤（ｂ）所述的人胰岛素原磺化是通过将人胰岛素原中的胱氨酸残基的巯基（－ＳＨ）取代为－ＳＳＯ↓［３］↑［－］实现的。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王伟刚，曹韫旭，文良柱，
申请(专利权)人：江苏万邦生化医药股份有限公司，上海复星医药集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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