B30位苏氨酸缺失人胰岛素晶体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种B30位苏氨酸缺失人胰岛素晶体的制备方法，属于重组人胰岛素及其类似物晶体的制备领域。本发明专利技术B30位苏氨酸缺失人胰岛素晶体的制备方法，包括以下步骤：(1)将B30位苏氨酸缺失人胰岛素溶解，加入有机溶剂、柠檬酸三钠、无机盐和锌离子，得到结晶液；(2)调节结晶液的pH值，进行结晶，即得。本发明专利技术试验发现，结晶液中柠檬酸三钠浓度、锌离子与B30位苏氨酸缺失人胰岛素的摩尔比以及有机溶剂浓度等对晶体的形态、大小以及收率等具有重要影响。本发明专利技术通过对结晶条件进行优化，使制备的B30位苏氨酸缺失人胰岛素晶体形状规则、大小均一，而且结晶的收率和纯度高，利于后续的修饰和纯化工艺。

Method for preparing B30 threonine deficient human insulin crystal

The invention discloses a method for preparing B30 threonine deletion human insulin crystal, which belongs to the preparation field of recombinant human insulin and its analogue crystal. The invention relates to a preparation method of B30 threonine deficiency of human insulin crystals, which comprises the following steps: (1) B30 threonine lack of human insulin solution, adding organic solvent, citric acid three, sodium salts and zinc ions, crystal liquid; (2) adjusting the pH value of solution crystallization, crystallization, i.e.. The invention has an important impact test, molar ratio of citric acid three sodium concentration, zinc ion and B30 threonine deficiency of human insulin crystal solution and organic solvent concentration on the crystal morphology, size and yield etc.. The crystallization conditions were optimized, the preparation of B30 threonine deficient human insulin crystal regular shape, uniform size, high yield and purity and crystallization, for subsequent modification and purification process.

【技术实现步骤摘要】
B30位苏氨酸缺失人胰岛素晶体的制备方法
本专利技术涉及胰岛素类似物(或人胰岛素前体)晶体的制备方法，尤其涉及一种B30位苏氨酸缺失人胰岛素(desB30)晶体的制备方法，属于重组人胰岛素及其类似物晶体的制备领域。
技术介绍
近年来随着人们生活水平的提升，糖尿病患者数量也持续增加。目前，糖尿病已成为继心脑血管疾病、恶性肿瘤后的第三大威胁人类健康的慢性非传染性疾病。中国糖尿病患病人数已突破一亿，并取代印度成为世界第一，世界卫生组织(WHO)预测至2025年全球糖尿病人数将突破3.0亿。胰岛素制品是公认的最有效的糖尿病治疗手段之一。随着科学技术的发展，从提取动物胰岛素到有机合成胰岛素、半合成人胰岛素，到现如今占主要市场的重组人胰岛素，胰岛素的工业化生产过程已经历了翻天覆地的变化。去除B30位苏氨酸的胰岛素(desB30)是通过重组微生物发酵得到胰岛素前体经纯化、酶切后得到的重要中间体，后续通过不同的修饰反应和纯化后可制备得到地特胰岛素、德谷胰岛素或其它胰岛素类似物。地特胰岛素是一种中性、可溶的长效胰岛素，它是原型胰岛素去除了B链第30为苏氨酸，通过酰化作用在B29位赖氨酸侧链氨基结合一个14碳的直链脂肪酸而成，具有药效长并可减少低血糖的出现等优点。德谷胰岛素是新一代可溶性、超长效基础胰岛素类似物，其分子保留了绝大部分的人胰岛素氨基酸序列，仅是去掉人胰岛素B链30位的苏氨酸，并通过谷氨酸连接子将一个十六碳脂肪二酸侧链连接到B29位赖氨酸上，具有药效长，低血糖发生率低的特点。虽然desB30样品经过胰岛素前体发酵液微孔过滤、初级纯化、酶切和等电点沉淀，但由于发酵产物的成分相对复杂，酶切得到的desB30纯度约在80％左右，还是有很多可见和不可见的色素或其它蛋白或核酸等，影响后续工艺的开发，同时易造成对纯化介质的污染，影响其使用次数。除此之外，直接等电点沉淀的desB30还存在不稳定、易降解或脱氨等缺点，因此需要增加一步工艺去除这些杂质，提高澄清度和纯度以及储存稳定性。通过对desB30样品进行结晶工艺研究，获得晶型相对均一的晶体，desB30以固态晶体形式存在，样品更稳定，更易贮存。另外desB30晶体的纯度高，有利于后续修饰反应的开展。因此，进行desB30的结晶工艺研究具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种B30位苏氨酸缺失人胰岛素(desB30)晶体的制备方法，该方法操作简单，结晶的收率高，所制备的desB30晶体形状规则、大小均一，而且纯度高。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术首先公开了一种B30位苏氨酸缺失人胰岛素晶体的制备方法，包括以下步骤：(1)将B30位苏氨酸缺失人胰岛素溶解，加入有机溶剂、锌离子、柠檬酸三钠和无机盐，得到结晶液；(2)调节结晶液的pH值，进行结晶，即得。其中，步骤(1)所述结晶液中柠檬酸三钠的浓度为0.01-0.1M，优选为0.01-0.05M，更优选为0.025-0.05M，最优选为0.04-0.05M。步骤(1)所述结晶液中锌离子与B30位苏氨酸缺失人胰岛素的摩尔比为7-20：1，优选为10-15：1，更优选为10-12：1，最优选为10-11：1。所述锌离子来自于常见的锌源，优选的，所述锌离子来自于氯化锌、醋酸锌或碘化锌中的任意一种，优选为氯化锌或醋酸锌中的任意一种。步骤(1)所述结晶液中有机溶剂的体积百分比为5-20％，优选为8-18％，更优选为9-15％，最优选为10-15％；所述有机溶剂选自丙酮、乙腈或2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)中的任意一种，优选为丙酮。步骤(1)所述结晶液中无机盐的浓度为0.01-0.05M，优选为0.01-0.03M，最优选为0.01-0.02M。所述无机盐选自氯化钠、硫酸铵或醋酸铵中的任意一种或两种，优选为氯化钠。步骤(1)所述结晶液中B30位苏氨酸缺失人胰岛素的浓度为3-9g/L，优选为3-5g/L。步骤(1)所述溶解是用稀酸溶解B30位苏氨酸缺失人胰岛素；其中，所述稀酸的浓度为10-40mM，优选为15-30mM；最优选为20-25mM；所述稀酸选自盐酸、柠檬酸或醋酸中的任意一种。步骤(2)所述调节结晶液的pH值包括：先调节结晶液的pH值为7.6-8.5，然后加入有机酸调节pH值为5.7-6.2；优选为，先调节结晶液的pH值为7.8-8.0，然后加入有机酸调节pH值为5.8-6.0。其中，可采用常见的碱调节pH值至7.6-8.5，例如氨水或氢氧化钠，优选为氨水；所述有机酸为柠檬酸。步骤(2)所述结晶的方式选自①-②中的任意一种：①室温静置15-50min，低速搅拌3-6h，然后2-8℃静置5-9h，得到结晶；优选为，室温静置40-50min，低速搅拌3-4h，然后4℃静置8-9h，得到结晶；②室温静置5-6h，然后4℃静置8-10h。所述室温为10-25℃。B30位苏氨酸缺失胰岛素与人胰岛素相比，缺少一个氨基酸；与地特胰岛素相比，缺少在B29位赖氨酸侧链氨基酰化结合一个14碳的直链脂肪酸；与德谷胰岛素相比，缺少在B29位赖氨酸侧链通过谷氨酸连接子连接的16碳脂肪二酸侧链；所以，其结构和性质与人胰岛素、地特胰岛素或德谷胰岛素均不相同，其结晶方法需要进行探索。本专利技术desB30样品为等电点沉淀离心后收集的样品，纯度只有80％左右，可见和不可见的杂质较多，结晶难度大。本专利技术对desB30的结晶条件进行了优化。本专利技术试验发现，柠檬酸三钠对结晶体系影响较大，柠檬酸三钠浓度太低，结晶体系无法缓冲，会导致样品部分形成沉淀，无法结晶；柠檬酸三钠浓度过高，会导致上清中desB30样品的残余大幅增加，影响收率。本专利技术确定结晶液中柠檬酸三钠的浓度为0.025-0.05M，结晶效果好。结晶液中锌离子和desB30的摩尔比对结晶效率有显著的影响。锌离子和desB30的摩尔比在7-20：1范围内，desB30结晶效果较好，上清中残余的未结晶的desB30低于8.6％；而锌离子和desB30的摩尔比在10-15：1，desB30结晶效果更佳，上清残余比低于6.7％；锌离子和desB30的摩尔比为11：1，desB30结晶效果最佳；当锌离子和desB30的摩尔比超出上述范围，会导致上清中残余的未结晶的desB30量显著增加，影响收率。结晶液中有机溶剂浓度及desB30浓度对结晶的效果也有较大的影响。有机溶剂浓度虽对上清中残余的未结晶的desB30量影响不是很明显，但是对晶体大小影响明显。有机溶剂浓度过高，体积百分比超出20％后，晶体大小会明显变小。因此，本专利技术确定有机溶剂比例在10-15％，desB30结晶效果较好。结晶液中desB30的浓度较低时，结晶残余虽然比较低，但结晶效率比较低，不适合生产；当蛋白浓度比较高，达14g/L，会导致上清中残余的未结晶的desB30量明显增加；当蛋白浓度过高，达20g/L，会导致蛋白沉淀从而无法结晶。因此，本专利技术确定DesB30蛋白浓度在3-9g/L，结晶效果较好。酸调节结晶液的pH终点也会对上清中残余的未结晶的desB30比例产生影响，pH超出5.7-6.2，尤其是超出5.8-6.0的范围会导致desB30损失明显增加。结晶方式对最后晶体的形态以及收率影响很大。本专利技术试验发现本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种B30位苏氨酸缺失人胰岛素晶体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将B30位苏氨酸缺失人胰岛素溶解，加入有机溶剂、锌离子、柠檬酸三钠和无机盐，得到结晶液；(2)调节结晶液的pH值，进行结晶，即得。

【技术特征摘要】
1.一种B30位苏氨酸缺失人胰岛素晶体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将B30位苏氨酸缺失人胰岛素溶解，加入有机溶剂、锌离子、柠檬酸三钠和无机盐，得到结晶液；(2)调节结晶液的pH值，进行结晶，即得。2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述结晶液中柠檬酸三钠的浓度为0.01-0.1M，优选为0.01-0.05M，最优选为0.025-0.05M。3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述结晶液中锌离子与B30位苏氨酸缺失人胰岛素的摩尔比为7-20：1，优选为10-15：1，更优选为10-12：1，最优选为10-11：1；所述锌离子选自氯化锌、醋酸锌或碘化锌中的任意一种，优选为氯化锌或醋酸锌中的任意一种。4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述结晶液中有机溶剂的体积百分比为5-20％，优选为8-18％，更优选为9-15％，最优选为10-15％；所述有机溶剂选自丙酮、乙腈或2-甲基-2,4-戊二醇中的任意一种，优选为丙酮。5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述结晶液中无机盐的浓度为0.01-0.05M，优选为0.01-0.03M，最优选为0.01-0.02...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘海峰，聂洪霞，应欢，周祥山，解福生，黄菁，李志，庞甲佩，史兆松，
申请(专利权)人：昂德生物药业有限公司，东阿阿胶股份有限公司，华东理工大学，
类型：发明
国别省市：山东,37