地特胰岛素晶体的洗涤方法技术

本发明专利技术公开了一种地特胰岛素晶体的洗涤方法。本发明专利技术地特胰岛素晶体的洗涤方法包括以下步骤：(1)结晶反应完成后，移除结晶溶液，加入弱酸盐溶液对留下的地特胰岛素晶体进行第一次洗涤；(2)移除第一次洗涤产生的洗涤液，加入弱酸盐溶液对留下的地特胰岛素晶体进行第二次洗涤；(3)移除第二次洗涤产生的洗涤液，加入注射用水对留下的地特胰岛素晶体进行第三次洗涤；(4)移除洗涤液，将地特胰岛素晶体冷冻冻干。本发明专利技术方法能够将结晶后的地特胰岛素晶体高效洗涤，洗涤后的地特胰岛素晶体保持完整，样品收率高、对样品纯度无影响。本发明专利技术洗涤方法操作简单，成本低，适于工业化的放大性生产。

The washing method of insulin detemir crystal

The invention discloses a washing method for insulin detemir crystal. The washing method of the invention of insulin detemir crystal comprises the following steps: (1) the crystallization reaction is completed, remove the crystallization solution, adding to the insulin detemir left the first washing crystal salt solution; (2) to remove the first washing liquid washing the addition of insulin detemir crystals left second times washing weak acid salt solution; (3) the washing liquid is washed second times to remove the injection water third times washing of insulin detemir crystal left; (4) remove the washing liquid, the insulin detemir crystal freeze-dried. The method of the invention can be washed after crystallization crystal, insulin detemir, insulin detemir crystal after washing samples intact, high yield and purity of sample had no effect. The washing method of the invention has the advantages of simple operation and low cost, and is suitable for industrial scale-up production.

【技术实现步骤摘要】
地特胰岛素晶体的洗涤方法
本专利技术涉及地特胰岛素晶体的洗涤方法，属于地特胰岛素晶体的制备领域。
技术介绍
糖尿病已成为继心脑血管疾病、恶性肿瘤后的第三大威胁人类健康的慢性非传染性疾病。世卫组织2016年年度全球糖尿病报告中指出，中国糖尿病患病率呈爆炸式增长。2010年中国糖尿病的患病率已达到9.7％，2015年中国的糖尿病患者数量已超过1.1亿。中国每年投入超过1700亿人民币用于糖尿病管理；用于糖尿病的直接医疗支出更是占到中国医疗总支出的13％。世界卫生组织预计，若不尽快采取行动，到2040年中国的糖尿病患者将增至1.5亿人，给国人健康和社会经济带来严重影响。地特胰岛素，即赖氨酸B29N(ε-十四酰)去(B30)人胰岛素，是第一个采用化学修饰的方法，用能与血液中的白蛋白可逆结合的脂肪酸酰化肽链上的氨基酸而产生。地特胰岛素作为一种中性的、可溶的、长效胰岛素类似物，是通过酰化作用在B29位的赖氨酸上结合了一个14碳的脂肪酸而形成。酰化的脂肪酸可稳定胰岛素分子的自身聚集，且与白蛋白可逆性结合，使地特胰岛素从皮下注射部位吸收缓慢，作用持续时间延长，在控制血糖的同时能减少低血糖的风险。地特胰岛素2004年在欧盟上市，2005年在美国上市，2013年销售额20.57亿美元，2014年销售额25.21亿美元，2015年销售额超过32亿美元，近三年年均增长超过25％。以固态晶体形式存在的胰岛素，相比较于非结晶形式的沉淀粉末及溶液状态保存的样品，在产品稳定性、方便性方面均有优势，同时也利于后续的制剂配方设计。由于结晶体系中含有高盐、有机溶剂和其它试剂，这些物质含量远高于原料药和制剂药的质量标准，需要进行有效洗涤后才可成为合格的原料药品。根据胰岛素类产品不易溶于水的性质，同时参考中国专利CN102219851A晶体洗涤工艺，发现低速离心并使用注射用水进行洗涤，得到的晶体蛋白易碎裂，晶型均一性差，洗涤过程晶体沉降慢，部分晶体易溶解，得率低。中国专利CN102219851B，使用pH7.8浓度0.02mol/L的乙酸铵进行晶体洗涤，采用溶液替换的方法进行，洗涤过程中也发现晶体难以沉降，替换后30分钟观察沉降晶体明显减少，取晶体镜检发现地特胰岛素晶体蛋白大部分溶解且晶体破裂明显。因此，亟待开发一种新的地特胰岛素晶体的洗涤方法，将结晶后的地特胰岛素晶体蛋白高效洗涤。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种地特胰岛素晶体的洗涤方法，该方法能够将经过结晶操作后的地特胰岛素晶体蛋白高效洗涤，洗涤后的地特胰岛素晶体保持完整，样品收率高、对样品纯度无任何影响，且操作简单。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术公开了一种地特胰岛素晶体的洗涤方法，包括以下步骤：(1)结晶反应完成后，将结晶溶液从结晶反应产物中移除，加入弱酸盐溶液对留下的地特胰岛素晶体进行第一次洗涤；(2)移除第一次洗涤产生的洗涤液，加入弱酸盐溶液对留下的地特胰岛素晶体进行第二次洗涤；(3)移除第二次洗涤产生的洗涤液，加入注射用水对留下的地特胰岛素晶体进行第三次洗涤；(4)移除洗涤液，将地特胰岛素晶体冷冻冻干。其中，步骤(1)或步骤(2)中所述的洗涤是将弱酸盐溶液与地特胰岛素晶体混合，搅拌，静置；步骤(3)所述的洗涤是将注射用水与地特胰岛素晶体混合，搅拌，静置；更优选的，所述的搅拌是轻微的搅拌，所述的静置时间优选为≥2小时，更优选为2-4小时，最优选为3小时；优选的，步骤(1)-(3)中的洗涤操作是在4-8℃的温度条件下进行洗涤。优选的，所述的注射用水的温度为4-8℃；为了达到更佳的洗涤效果，步骤(1)中最好将大部分或全部的结晶溶液移除，所加入的弱酸盐溶液与所移除的结晶溶液的体积相等；步骤(2)中最好也是将大部分或全部的洗涤液移除，所加入的弱酸盐溶液与所移除的洗涤液的体积相等；其中，所述的“大部分”是指占总体积的70％或以上。步骤(3)中所所加入的注射用水的体积最好不低于第二次洗涤产生的洗涤液总体积的1/3；优选的，所加入的注射用水的体积为第二次洗涤产生的洗涤液的体积的1/3倍-1倍。为了达到更佳的洗涤效果，可以在进行第三次洗涤后接着再进行第四次洗涤；其中，所述的第四次洗涤包括：移除第三次洗涤产生的洗涤液，加入注射用水对留下的地特胰岛素晶体进行第四次洗涤；在进行第四次洗涤后再接着进行第五次洗涤，所述的第五次洗涤包括：移除第四次洗涤产生的洗涤液，加入注射用水对留下的地特胰岛素晶体进行第五次洗涤；第四次以及第五次的洗涤方式与第三次的洗涤操作可以完全相同；如果需要进一步提高洗涤效果，还可以用注射用水作为洗涤液完全按照第三次的洗涤方法进行多次的洗涤。优选的，在进行第四次洗涤时，所加入注射用水的体积最好不低于第二次洗涤产生的洗涤液体积的1/3；同样的，在进行第五次洗涤时，所加入注射用水的体积最好不低于第二次洗涤产生的洗涤液体积的1/3；更优选的，在进行第四次或第五次洗涤时，所加入的注射用水的体积为第二次洗涤产生的洗涤液的体积的1/3倍-1倍。步骤(1)中所述的弱酸盐溶液的pH值为2.8-4.5，为了达到较佳的洗涤效果，所述的弱酸盐溶液的pH值优选为3.0-4.0，更优选为3.5；所述弱酸盐溶液选自磷酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐或醋酸盐中的任意两种按照任意比例组成的混合溶液或两种以上按照任意比例组成的混合溶液；优选的，所述弱酸盐溶液(盐溶液A)的浓度为0.02-0.06mol/L。所述弱酸盐溶液由磷酸盐和柠檬酸盐按照任何比例组成的混合溶液；优选的，在混合溶液中，磷酸盐的浓度为0.01-0.03mol/L，柠檬酸盐的浓度为0.01-0.03mol/L；更优选的，在混合溶液中，磷酸盐的浓度为0.02mol/L，柠檬酸盐的浓度为0.015mol/L；优选的，所述磷酸盐为磷酸氢二钠，更优选的，所述柠檬酸盐为柠檬酸铵。步骤(2)中所述的弱酸盐溶液(盐溶液B)的pH值为4.0-7.0，为了达到更佳的效果，优选为5.0-6.0，更优选为5.6；步骤(2)中所述弱酸盐溶液可以选自磷酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐或醋酸盐中的任意一种或一种以上按照任意比例混合的弱酸盐溶液；优选的，所述弱酸盐溶液的浓度为0.01-0.03mol/L，所述弱酸盐溶液最好为柠檬酸盐溶液；其中，柠檬酸盐的浓度最好为0.015mol/L；所述柠檬酸盐可以为柠檬酸铵。本专利技术地特胰岛素晶体的洗涤方法，将地特胰岛素结晶后的结晶溶液或洗涤液大部分都移除，然后加入下一步适量体积的洗涤溶液。本专利技术中被移除部分溶液的体积根据最初的结晶体积确定，剩余溶液不超过移除前溶液体积的3％，根据结晶总体积进行调整，剩余溶液越少，洗涤效果越好。地特胰岛素结晶的方法在本领域内是已知的，例如可以参见中国专利CN104761632A中公开的方法。本专利技术所述地特胰岛素结晶样品为参考中国专利CN104761632A中公开的方法制备获得，因此结晶后溶液中含有地特胰岛素、酚类物质、有机溶剂、锌离子、柠檬酸三钠以及其他盐等。具体的，地特胰岛素结晶的制备包括：(1)纯化获得纯度为99.5％地特胰岛素溶液0.7L，浓度10.4g/L；(2)称取氯化钠20.45g，柠檬酸三钠二水102.92g，6％苯酚溶液40.8ml，加水溶解并定容至2.8L，配制得到盐溶液；(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种地特胰岛素晶体的洗涤方法，其特征在于，包括：(1)结晶反应完成后，移除结晶溶液，加入弱酸盐溶液对留下的地特胰岛素晶体进行第一次洗涤；(2)移除第一次洗涤产生的洗涤液，加入弱酸盐溶液对留下的地特胰岛素晶体进行第二次洗涤；(3)移除第二次洗涤产生的洗涤液，加入注射用水对留下的地特胰岛素晶体进行第三次洗涤；(4)移除洗涤液，将地特胰岛素晶体冷冻冻干。

【技术特征摘要】
1.一种地特胰岛素晶体的洗涤方法，其特征在于，包括：(1)结晶反应完成后，移除结晶溶液，加入弱酸盐溶液对留下的地特胰岛素晶体进行第一次洗涤；(2)移除第一次洗涤产生的洗涤液，加入弱酸盐溶液对留下的地特胰岛素晶体进行第二次洗涤；(3)移除第二次洗涤产生的洗涤液，加入注射用水对留下的地特胰岛素晶体进行第三次洗涤；(4)移除洗涤液，将地特胰岛素晶体冷冻冻干。2.按照权利要求1所述的洗涤方法，其特征在于，步骤(1)或步骤(2)中所述的洗涤是将弱酸盐溶液与地特胰岛素晶体混合，搅拌，静置；步骤(3)中所述的洗涤是将注射用水与地特胰岛素晶体混合，搅拌，静置；优选的，所述的注射用水的温度为4-8℃；优选的，所述的搅拌是轻微的搅拌，所述的静置时间优选为≥2小时，更优选为2-4小时，最优选为3小时；优选的，步骤(1)-(3)中所述的洗涤操作均是在4-8℃的温度条件下进行。3.按照权利要求1所述的洗涤方法，其特征在于，步骤(1)中将大部分或全部的结晶溶液移除，所加入的弱酸盐溶液与所移除的结晶溶液的体积相等；步骤(2)中将大部分或全部的洗涤液移除，所加入的弱酸盐溶液与所移除的洗涤液的体积相等；步骤(3)中将大部分或全部的洗涤液移除，所加入的注射用水的体积不低于所移除的第二次洗涤产生的洗涤液的体积的1/3；优选的，所加入的注射用水的体积为第二次洗涤产生的洗涤液的体积的1/3倍-1倍。4.按照权利要求1所述的洗涤方法，其特征在于，进行第三次洗涤后接着再进行第四次洗涤；其中，所述的第四次洗涤包括：移除第三次洗涤产生的洗涤液，加入注射用水对留下的地特胰岛素晶体进行第四次洗涤；进一步优选的，进行第四次洗涤后再接着进行第五次洗涤；其中，所述的第五次洗涤包括：移除第四次洗涤产生的洗涤液，加入注射用水对留下的地特胰岛素晶体进行第五次洗涤；优选的，所述的洗涤是将注射用水与地特胰岛素晶体混合，搅拌，静置；更优选的，所述的搅拌...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘海峰，应欢，周祥山，黄菁，许波，马立平，聂洪霞，刘立岗，史兆松，
申请(专利权)人：昂德生物药业有限公司，东阿阿胶股份有限公司，华东理工大学，
类型：发明
国别省市：山东,37