复合物、蛋白质及二者的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种复合物、蛋白质及二者的制备方法，涉及生物医药的技术领域。本发明专利技术提供的蛋白质的制备方法，在75‑85℃的条件下进行物理脱氧，能够大大提高蛋白质的纯度；本发明专利技术提供的蛋白质，利用了本发明专利技术提供的蛋白质的制备方法制备得到，纯度达到80％以上；本发明专利技术提供的复合物稳定性强，蛋白质能够将胰岛素均一的、紧密的包合在内，并能有效避免胰岛素在肠胃的降解，在利用胰岛素达到长效降血糖功能的基础上，实现能够通过口服的方式给药，且利用度高，为糖尿病相关药物的进一步开发奠定了基础，值得后续的继续研发。

Composite, protein and process for preparing the two

The invention provides a compound, a protein and a preparation method of the two, and relates to the technical field of biomedicine. Protein preparation method provided by the invention, the physical deoxidation in 75 85 C conditions, can greatly improve the purity of proteins; the invention provides the use of protein protein, the preparation method of the preparation, the purity is above 80%; complex stability provided by the invention. Protein can be Shima Sokyunchi, close the inclusion, and can effectively avoid the degradation of insulin in the stomach, based on insulin achieve long-acting hypoglycemic function, can be administered orally, and the utilization rate is high, which lays a foundation for the further development of diabetes related drugs, further continued development.

【技术实现步骤摘要】
复合物、蛋白质及二者的制备方法
本专利技术涉及生物医药
，尤其是涉及一种复合物、蛋白质及二者的制备方法。
技术介绍
糖尿病(Diabetesmellitus，DM)是以胰岛素相对或绝对不足为特征的代谢性疾病，胰岛素相对或绝对不足引发高血糖，进而导致三大营养物质代谢紊乱，最终影响患者正常生理功能并且引起并发症。全球糖尿病患者与日俱增，预计2030年将达到4.39亿。胰岛素于1922年开始用于临床，是目前治疗糖尿病的最有效的药物之一。长期以来，胰岛素一直以注射给药为主，胰岛素是I型和中重度II型糖尿病患者每日治疗中不可缺少的药物。由于胰岛素生物半衰期短，糖尿病患者需要终生每日皮下注射胰岛素，长期频繁注射给患者带来很大痛苦和诸多不便，而且长期注射胰岛素还可能产生皮下脂肪萎缩、出现浮肿等，超剂量给药还会引起低血糖休克等多种不良反应。因此，研制开发非注射给药的胰岛素制剂是近年来国内外研究的热点。但不经特殊的技术处理的普通胰岛素口服制剂生物利用度只有0.1％-0.2％，无临床意义。其主要原因有以下几点：(1)胰岛素是一种肽类激素，其在胃液酸性环境和消化道各种蛋白酶的作用下，极易降解失活；(2)胰岛素分子量为6000左右，且分子间有很强的聚合趋势，从而使其难以通过扩散被胃肠壁的上皮细胞层吸收；(3)存在肝脏首过效应，生物利用度低；(4)制备过程中的胰岛素构象问题。胰岛素的口服给药一直是一个世界性的难题。因此，开发一种能口服利用度高的，利用胰岛素达到长效降血糖功能的稳定的蛋白质复合物日益成为研究的热点。同时，提供一种高纯度的，与胰岛素能够形成稳定复合物的蛋白质也尤为重要。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种复合物，以缓解现有技术中存在的利用胰岛素降糖不能实现口服，且时效短的技术问题。本专利技术的第二个目的在于提供一种复合物的制备方法。本专利技术的第三个目的在于提供一种蛋白质的制备方法，以缓解现有技术中存在的纯化方法纯化得到的蛋白质纯度低的技术问题。本专利技术的第四个目的在于提供一种蛋白质，以缓解现有技术中存在的蛋白质纯度低的技术问题。本专利技术提供的一种复合物，包括蛋白质和胰岛素。进一步地，所述蛋白质是如下(1)、(2)或(3)：(1)由序列表中SEQIDNO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(2)由序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(3)将SEQIDNO.1或SEQIDNO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由其衍生的蛋白质。本专利技术还提供了一种上述的复合物的制备方法，包括如下步骤：步骤(a)：将所述蛋白质与所述胰岛素按照摩尔比例1:20-10:1溶于mops缓冲液中，得到混合液，并调整pH至1.7-10.8；步骤(b)：将所述混合液于25-35℃进行孵育后，充分震荡；步骤(c)：将经震荡的混合液进行超生波处理；步骤(d)：冷藏降温过夜。进一步地，所述步骤(b)中进行孵育的时间为10-30min，震荡的时间为3-10min。进一步地，所述步骤(d)中超声波处理的时间为1-5min，所述冷藏的温度为4℃。本专利技术还提供了上述的蛋白质的制备方法，包括：调节酵母发酵液的pH至2.0-4.0，放置8-12h后，加热至75-85℃，进行物理脱氧，离心并收集沉淀。进一步地，所述酵母发酵液为Pichia酵母发酵液。进一步地，所述物理脱氧的方法为将惰性气体鼓泡入所述Pichia酵母发酵液的内部。进一步地，所述物理脱氧的时间为2-6h。另外，本专利技术还提供了一种蛋白质，应用上述的制备方法制备得到。本专利技术提供的复合物稳定性强，蛋白质能够将胰岛素均一的、紧密的包合在内，并能有效避免胰岛素在肠胃的降解，在利用胰岛素达到长效降血糖功能的基础上，实现能够通过口服的方式给药，且利用度高，为糖尿病相关药物的进一步开发奠定了基础，值得后续的继续研发；本专利技术提供的蛋白质的制备方法，在75-85℃的条件下进行物理脱氧，能够大大提高蛋白质的纯度；本专利技术提供的蛋白质，利用了本专利技术提供的蛋白质的制备方法制备得到，纯度达到80％以上。并且，通过本专利技术提供的蛋白质纯化办法能够除去酵母菌发酵引入的热毒蛋白和核酸物质，为蛋白质作为药物制剂的应用后期的安全性和质量研究带来便利。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1A为本专利技术提供的蛋白质的液相色谱结果图；图1B为胰岛素的液相色谱结果图；图1C为本专利技术提供的蛋白质与胰岛素在摩尔比1：1时的液相色谱结果图；图1D为本专利技术提供的蛋白质与胰岛素在摩尔比1：5时的液相色谱结果图；图1E为本专利技术提供的蛋白质与胰岛素在摩尔比1：10时的液相色谱结果图；图1F为本专利技术提供的蛋白质与胰岛素在摩尔比1：20时的液相色谱结果图；图2为正常小鼠口服本专利技术提供的复合物对血糖调控功能的结果图；图3为糖尿病大鼠口服专利技术提供的复合物对血糖的调控功能的结果图；图4A为100nM的复合物的TEM电镜扫描结果图；图4B为10μM的复合物的TEM电镜扫描结果图；图4C为1mM的复合物的TEM电镜扫描结果图；图4D为DLS测定本专利技术提供的复合物纳米球直径试验结果图；图5为本专利技术提供的复合物扫描电子显微镜结果图；图6为本专利技术提供的制备方法制备得到的蛋白质经硫酸锌处理后的电泳结果图。具体实施方式为了更清楚地说明本专利技术，下面结合优选实施例对本专利技术做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本专利技术的保护范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。传统的蛋白纯化，一般采用直接超滤或液相纯化的方法，在收率和初纯度上效果均不理想，不仅浪费原材料，而且增加了能源及人工成本。本专利技术针对现有技术中，蛋白收率和初纯度效果不理想的技术问题，提供了一种蛋白质的制备方法，包括：调节酵母发酵液的pH至2.0-4.0，放置8-12h后，加热至75-85℃，进行物理脱氧，离心并收集沉淀。其中，pH值例如可以为，但不限于2.0,3.0或4.0；放置时间例如可以为，但不限于8h，9h，10h，11h或12h；加热温度例如可以为，但不限于75℃，80℃或85℃。在本专利技术中，蛋白质是如下(1)、(2)或(3)：(1)QQCTTGQLQCCESTSTANDPATSELLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV(SEQIDNO.1)；(2)QQCTTGQLQCCESTSTANDPATSKLLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV(SEQIDNO.2)；(3)将SEQIDNO.1或SEQIDNO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由其衍生的蛋白质。例如可以为，但不限于：QQCTT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种复合物，其特征在于，所述复合物包括蛋白质和胰岛素。

【技术特征摘要】
1.一种复合物，其特征在于，所述复合物包括蛋白质和胰岛素。2.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述蛋白质是如下(1)、(2)或(3)：(1)由序列表中SEQIDNO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(2)由序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(3)将SEQIDNO.1或SEQIDNO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由其衍生的蛋白质。3.如权利要求1或2所述的复合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：步骤(a)：将所述蛋白质与所述胰岛素按照摩尔比例1:20-10:1溶于mops缓冲液中，得到混合液，并调整pH至1.7-10.8；步骤(b)：将所述混合液于25-35℃进行孵育后，充分震荡；步骤(c)：将经震荡的混合液进行超生波处理；步骤(d)：冷藏降温过夜。4.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：高井珍，
申请(专利权)人：天津世传生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12