双相性单链胰岛素类似物制造技术

单链胰岛素包含6‑11个氨基酸残基的C‑结构域，其包含在C‑结构域的N‑末端侧的至少两个酸性残基和在C‑结构域肽的C‑末端侧的至少两个碱性残基；位于对应于人胰岛素的A8的位置的碱性氨基酸残基；和位于对应于人胰岛素的A14的位置的酸性氨基酸残基。C‑结构域可包含在酸性和碱性残基之间的2‑4个氨基酸的连接区。残基C1和C2可具有‑1或‑2的净负电荷；和剩余的C‑结构域区段可以两个碱性残基结束。药物组合物包含在范围7.0‑8.0内的pH下配制的所述单链胰岛素，和可以0.6 mM‑5.0 mM的浓度和/或以U‑100至U‑1000的强度配制。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】双相性单链胰岛素类似物关于联邦资助的研究或开发的声明本专利技术在国立卫生研究院授予的合作协议下，在授予号DK040949和DK074176下以政府支持进行。美国政府对本专利技术可具有一定的权利。专利技术背景本专利技术涉及显示增强的药学性质的多肽激素类似物，所述增强的药学性质例如热力学稳定性增加、对高于室温的热纤维化的抗性增强、促有丝分裂性降低和/或药代动力学和药效学性质改变，即，相对于(a)类似于对应的膳食或野生型人激素的可溶性制剂的速效组分和(b)类似于野生型胰岛素或胰岛素类似物的微晶NPH制剂的长效组分，赋予双相性作用时程。更特别地，本专利技术涉及由单一多肽链组成的胰岛素类似物，其(i)包含一类新的在A和B结构域之间缩短连接的(C)结构域，其中第一和第二位置为酸性残基；(ii)包含位置A8的氨基酸置换；和(iii)包含位置A14的酸性残基。长度6-11个残基的该类型的C结构域由类似于野生型前胰岛素的N-末端酸性元件和C-末端区段碱性元件组成。本专利技术的单链胰岛素类似物可任选地包含在A或B结构域的其它位点的标准或非标准氨基酸置换，例如本领域已知赋予速效作用的位置B28和B29。非标准蛋白质，包括治疗剂和疫苗的工程改造，可具有广泛的医学和社会益处。天然存在的蛋白质—如通常在人类、其它哺乳动物、脊椎生物、无脊椎生物或真核细胞的基因组中所编码的—经常赋予多种生物学活性。非标准蛋白质的益处将实现选择性活性，例如与无意和不利的副作用(例如促进癌细胞的生长)有关的同源细胞受体的结合降低。社会益处的又一实例将是对室温或高于室温的降解的抗性增强，促进运输、分配和使用。治疗性蛋白质的实例提供为胰岛素。野生型人胰岛素和其它哺乳动物的基因组中编码的胰岛素分子结合在多种器官和各种类型的细胞中的胰岛素受体，不管由可选的RNA剪接模式或由可选的翻译后糖基化模式产生的受体同种型如何。野生型胰岛素还以较低的亲和力结合同源的1型胰岛素-样生长因子受体(IGF-1R)。其它医学益处的实例将是可溶性制剂的药代动力学性质的优化，使得胰岛素作用时程具有两个阶段，快速阶段和延迟阶段(图1)。快速和延迟阶段的这样的组合在本领域已知由锌胰岛素类似物六聚体的溶液(如通过但不限于赖脯胰岛素和门冬胰岛素提供)与所述类似物的微晶混悬液(与锌离子和鱼精蛋白或鱼精蛋白相关的碱性肽组合制备)的混合物赋予；后一组分在本领域被称为NeutralProtamineHagedorn(NPH)微晶混悬液。本领域已知的预混合胰岛素产品包含各种比率的这两种组分，例如25％可溶相和75％微晶相、30％可溶相和70％微晶相、或50％的各相。由于这样的预混合产品易于使用，相对于单独给予膳食(速效)胰岛素制剂(或膳食胰岛素类似物制剂)和野生型胰岛素或胰岛素类似物的NPH微晶混悬液，每天皮下注射次数减少，因此它们广泛用于发展中国家的糖尿病患者。由预混合双相性胰岛素产品提供的胰岛素的胰岛素方案的简化还已证明了对以下患者的益处：富裕人社会的糖尿病患者，(i)对于他们而言，单独通过膳食胰岛素类似物制剂治疗导致亚最佳的糖血控制或过度体重增加；(ii)对于他们而言，单独通过NPH胰岛素产品或基础胰岛素类似物制剂治疗导致亚最佳的糖血控制，这是由于在餐后3小时内血糖浓度向上偏移导致；或(iii)上述两种类型的患者，对于他们而言，加入口服药(例如二甲双胍)不导致令人满意的糖血控制。由于发酵后和纯化后步骤需要生长NPH微-结晶，现有的双相性胰岛素产品需要复杂和昂贵的生产方法。此外，这样的产品经受可溶性和微晶组分二者对高于室温的物理和化学降解的内在敏感性。由于在可溶相和微晶相之间胰岛素分子的互换，这些预混合产品的双相性药代动力学性质可随小管在高于室温下的贮存而变化。最后，因为抽吸入注射器的微-结晶的数量可随不同抽吸而(即使来自同一小管)变化，使用微晶混悬液可能伴有剂量的不确定性。根据目前的双相性胰岛素产品的上述缺点，双相性胰岛素制剂的治疗性和社会益处会通过工程改造胰岛素类似物来提高，所述胰岛素类似物作为单一组分可溶性溶液的药代动力学性质赋予双相性模式的胰岛素作用。如果该新型的可溶性胰岛素类似物制备较简单和成本较低(即，避免对于微-结晶的需要)和/或如果该新型的可溶性胰岛素类似物比野生型胰岛素更耐受在室温下或高于室温的化学或物理降解，会获得另外的益处。所述耐受高于室温的降解将预期促进在发展中国家地区(其中不能持续获得电力和冷藏)中使用。这样的降解造成的挑战通过非洲和亚洲的即将发生的糖尿病大流行被加深。因为纤维化造成在高于室温的降解主要途径，抵抗纤维化的制剂的设计可提高在这样的受到挑战的地区中胰岛素替换疗法的安全性和功效。如果可溶性双相性胰岛素类似物应在经开发以监测胰岛素-刺激的人癌细胞系增殖的测定法中显示促有丝分裂性降低，会获得再另外的治疗性和社会益处。很久以前就已将给予胰岛素确立为用于糖尿病的治疗。在糖尿病患者中常规胰岛素替换疗法的主要目的是紧密控制血糖浓度以防止其高于或低于健康人受试者特有的正常范围的偏移。低于正常范围的偏移伴随有直接肾上腺素能症状或神经性低血糖症状(neuroglycopenicsymptoms)，其在严重发作时其导致惊厥、昏迷和死亡。高于正常范围的偏移伴随有微血管疾病的长期风险增加，包括视网膜病变、失明和肾衰竭。胰岛素是一种小的球状蛋白质，其在脊椎动物的新陈代谢中起重要作用。胰岛素包含两条链，包含21个残基的A链和包含30个残基的B链。该激素在胰腺β-细胞中作为Zn2+-稳定的六聚体贮存，但在血流中作为无Zn2+-单体发挥作用。胰岛素是单链前体前胰岛素的产物，在该前胰岛素中连接区域(35个残基)连接B链的C-末端残基(残基B30)与A链的N-末端残基。各种证据表明，其由胰岛素-样的核心和杂乱的连接肽组成。认为三个特定的二硫桥(A6–A11、A7–B7和A20–B19)的形成与前胰岛素在粗糙内质网(ER)中的氧化折叠有关。前胰岛素在从ER输出至高尔基体后不久装配形成可溶性Zn2+-配位的六聚体。内部蛋白水解消化和转化为胰岛素在未成熟的分泌颗粒中发生，接着形态学浓缩。在成熟贮藏颗粒中晶状排列的锌胰岛素六聚体已通过电子显微术(EM)可视化。每个残基通过氨基酸的身份(通常使用标准三字母代码)、链和序列位置(通常作为上标)指明。本专利技术涉及长度6-11个残基的新型缩短的C结构域的专利技术，其包含N-末端酸性基序和C-末端碱性基序，替换了人前胰岛素特有的36-残基野生型C结构域；和与A链的位置A8和A14，和任选地B链的位置B28和B29的氨基酸置换组合。纤维化，其为一种在用于治疗糖尿病的胰岛素和胰岛素类似物的生产、储存和使用中的严重顾虑，随更高温度、更低pH、搅动或存在脲、胍、乙醇共溶剂或疏水表面而增强。当前的美国药物条例要求如果发生1％或更高水平的纤维化，则胰岛素被丢弃。因为纤维化在较高温度下增强，糖尿病患者最好在使用前必须保持胰岛素冷藏。胰岛素显示在高于25℃的温度下每10℃增量，降解速率增加10倍或更高；因此，指导方针要求在<30℃的温度下贮存和优选地冷藏。现有的双相性胰岛素产品的NPH微晶组分对高于室温的纤维化，以及由于A链内的蛋白水解裂解导致的不同的化学降解模式敏感；这样的裂解使胰岛素或本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单链胰岛素，包含：6‑11个氨基酸残基的C‑结构域，包含在所述C‑结构域的N‑末端侧的至少两个酸性残基和在所述C‑结构域肽的C‑末端侧的至少两个碱性残基；位于对应于人胰岛素的A8的位置的碱性氨基酸残基，和位于对应于人胰岛素的A14的位置的酸性氨基酸残基。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.06 US 62/0601671.一种单链胰岛素，包含：6-11个氨基酸残基的C-结构域，包含在所述C-结构域的N-末端侧的至少两个酸性残基和在所述C-结构域肽的C-末端侧的至少两个碱性残基；位于对应于人胰岛素的A8的位置的碱性氨基酸残基，和位于对应于人胰岛素的A14的位置的酸性氨基酸残基。2.权利要求1的单链胰岛素，其中所述C-结构域具有在C-结构域的N-末端侧的氨基酸Glu-Glu。3.权利要求1或2的单链胰岛素，其中所述C-结构域具有在C-结构域的C-末端侧的氨基酸Arg-Arg、Lys-Lys、Arg-Lys或Lys-Arg。4.权利要求1-3中任一项的单链胰岛素，其中所述C-结构域包含在所述酸性残基和所述碱性残基之间的2-4个氨基酸的连接区。5.权利要求4的单链胰岛素，其中所述连接区基本上由甘氨酸、丝氨酸和脯氨酸残基中的一种或多种组成。6.权利要求5的单链胰岛素，其中所述连接区包含Gly-Pro或由其组成。7.权利要求1-6中任一项的单链胰岛素，其中位于对应于A8的位置的氨基酸是Lys、Arg、Hist或Orn。8.权利要求7的单链胰岛素，其中位于对应于A8的位置的氨基酸是Lys或Arg。9.权利要求1-8中任一项的单链胰岛素，其中位于对应于A14的位置的氨基酸是Glu。10.权利要求1-9中任一项的单链胰岛素，其中所述单链胰岛素包含位于对应于B28和/或B29的位置的氨基酸置换。11.权...

【专利技术属性】
技术研发人员：M维斯，
申请(专利权)人：卡斯西部储备大学，
类型：发明
国别省市：美国,US