胰岛素的制备方法技术

本发明专利技术提供胰岛素的制备方法。本发明专利技术涉及一种将胰岛素前体转化为活性胰岛素化合物、优选长效胰岛素的改进的方法。具体地讲，本发明专利技术提供一种方法，其中可逆地封闭Lys-Arg前体胰岛素中的赖氨酸残基，从而使胰蛋白酶能够准确切割经可逆封闭的Lys-Arg前体胰岛素。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及将胰岛素前体转化为长效活性胰岛素化合物的改进的方法。
技术介绍
胰岛素是参与血糖浓度调节的一种胰腺激素。例如，将人、猪和牛的胰岛素、胰岛素类似物和混合胰岛素给予胰岛素依赖型糖尿病患者，以调节他们的血糖浓度。成熟胰岛素是一种两条链的肽激素，含有51个氨基酸。其A-链由21个氨基酸组成，B-链由30个氨基酸组成。该分子含有2个链间二硫键和I个A-链内二硫键。在体内，该激素首先被合成为一条长的前体分子，即前胰岛素原(preproinsulin),随后被加工为胰岛素原(proinsulin)和胰岛素。最初的加工步骤是在初生链穿过内质网膜转移期间经蛋白水解而除去前肽。然后，胰岛素原折叠并伴随二硫键氧化并转运至高尔基体，在此包装成为分泌液泡。在此经特异性蛋白酶进一步加工形成成熟胰岛素。通过这样的蛋白水解切害I]，将胰岛素原中连接B链和A链的C-链(C肽)切去。C肽长度为35个氨基酸并在其氨基端和羧基端分别包含2对碱性氨基酸，即ArgArg和LysArg (Steiner, 1984)。一般认为，将两条胰岛素链连接在一起的C肽有助于合适的折叠和二硫键的形成。事实上，其缺失或被仅有一个到数个氨基酸长的较短的合成肽桥取代，仍然允许自胰岛素-样前体产生合适的胰岛素。直到20世纪80年代，胰岛素仍是从牛和猪的胰腺制品中分离。早期研究已经证明，可通过将呈S-磺酸形式的A链和B链结合或通过还原型胰岛素原的自发再氧化而在体外生产胰岛素。然后再 经胰蛋白酶和羧肽酶B处理而回收胰岛素。然而，这些方法对于大规模生产来说并不实用。以后，通过转肽作用(例如美国专利号4，343，898)，使用胰蛋白酶和苏氨酸，替代猪胰岛素中的B30丙氨酸(猪胰岛素和人胰岛素之间的唯一差异)，可自猪胰岛素产生半合成人胰岛素。例如EP87，238提供了在溶剂系统中进行的转肽反应，所述溶剂系统包含介于大约75%至97%(v/v)之间的至少一种非水反应易混溶剂，其包含至少大约50%(vol/vol)丁 -1，4- 二醇。通过使用L-丝氨酸特异性羧肽酶而进行的转肽方法公开于美国专利号4，579，820。
技术实现思路
在一个实施方案中，本专利技术提供一种制备胰岛素的方法，所述方法包括以下步骤:(a)可逆地封闭Lys-Arg前体胰岛素中的赖氨酸残基，包括使所述Lys-Arg前体胰岛素接触包含缓冲液和柠康酸酐的PH6-11的溶液；和(b)切割所述Lys-Arg前体胰岛素，包括使步骤(a)的所述Lys-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应，从而制备胰岛素。在一个实施方案中，本专利技术还提供一种制备胰岛素的方法，所述方法包括以下步骤:将Lys-Arg前体胰岛素暴露在11.0-11.5的pH值下；(b)可逆地封闭所述Lys-Arg前体胰岛素中的赖氨酸残基，包括使所述Lys-Arg前体胰岛素接触包含缓冲液和柠康酸酐的PH6-11的溶液；和(c)切割所述Lys-Arg前体胰岛素,包括使步骤(b)的所述Lys-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应，从而制备胰岛素。在一个实施方案中，本专利技术还提供一种制备胰岛素的方法，所述方法包括以下步骤:(a)可逆地封闭Lys-Arg前体胰岛素中的赖氨酸残基，包括使所述Lys-Arg前体胰岛素接触包含缓冲液和柠康酸酐的PH9的溶液；(b)切割所述Lys-Arg前体胰岛素，包括使步骤(a)的所述Lys-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应；和(c)将步骤(b)的所述胰岛素的pH调节至pH6-10(步骤(c))，从而制备胰岛素。在一个实施方案中，本专利技术的方法还包括胰岛素纯化操作，例如:微滤、离子交换色谱法、反相高压液相色谱法(RP-HPLC)或其任意组合。在一个实施方案中，本专利技术的方法还包括胰岛素结晶，包括在柠檬酸-乙醇(pH6.4)中使所述胰岛素接触Zn++。【附图说明】图1是描述自Lys-Arg胰岛素前体制备本专利技术胰岛素的方法流程。图2是膜岛素-LysArg生广流程。图3是纯化的胰岛素-LysArg的RP-HPLC分析图及与市售来得时(Lantus)的比较。来得时之前的峰是防腐剂间甲酚。图4是本专利技术的 重组人胰岛素-类似物前体表达盒的核苷酸序列和相应氨基酸序列。B链氨基酸在方框内。A链氨基酸在方框内。在胰岛素-类似物序列之前的最初64个氨基酸(编码Cu/Zn-超氧化物歧化酶的部分序列)和Lys Arg桥用粗体表示。RBS-核糖体结合位点。图5是显示在接受STZ的糖尿病诱导并随后经每天注射(见箭头)指定试验材料治疗的Sprague-Dawley雄性大鼠中的组平均土SD血糖值的图。上图是对媒介物对照血糖水平归一化后的表达。图6是通过本文所述方法产生的胰岛素的氨基酸序列(6A和6B)。图7显示在随机交叉研究中，在给予速效胰岛素(优泌林R)、长效胰岛素(来得时)和长效胰岛素即胰岛素-LysArg (胰岛素KR)之后,在患糖尿病的比格犬(beagle dog)中的血糖水平(mM)随时间(小时)变化的图。【具体实施方式】在一个实施方案中，本专利技术提供自胰岛素前体制备胰岛素的改进的方法。在另一个实施方案中，本专利技术提供自Lys-Arg胰岛素前体制备胰岛素的改进的方法。在另一个实施方案中，在本专利技术的改进的方法中，将Lys-Arg胰岛素前体在碱性pH中直接溶解并折叠，然后进行胰蛋白酶处理，从而以简单的改进方式产生胰岛素。在另一个实施方案中，依照本专利技术的方法利用Lys-Arg胰岛素前体,产生真实的人胰岛素或其长效B3 ILys_B32Arg变体。在另一个实施方案中，本专利技术的改进的方法包括:用柠康酸酐可逆地封闭Lys-Arg胰岛素前体中的Lys残基并用胰蛋白酶处理经可逆封闭的Lys-Arg胰岛素前体，从而切除前导肽和“C-链”连接。在另一个实施方案中，本专利技术的改进的方法包括:用柠康酸酐可逆地封闭LyS-Arg胰岛素前体中的Lys残基并用胰蛋白酶处理经可逆封闭的Lys-Arg胰岛素前体,从而切除前导肽和“c-链”连接，尤其是在Arg残基位置(参见图1)。在另一个实施方案中，本专利技术的方法通过提供前体胰岛素内的一个特异性胰蛋白酶切割位点而克服了现有技术水平的缺陷。在另一个实施方案中，本专利技术的方法是基于可逆地封闭前体胰岛素内的不想要的胰蛋白酶切割位点。在另一个实施方案中，可逆地封闭前体胰岛素内的不想要的胰蛋白酶切割位点，克服了现有技术水平的缺陷。在另一个实施方案中，通过在pH9(通过自动滴定而保持该pH值)与过量朽1康酸酐反应，所述前体蛋白中的所有赖氨酸残基都被可逆地封闭。在另一个实施方案中，剩余试剂被水解为柠康酸。在另一个实施方案中，剩余试剂通过加入5mM乙醇胺而猝灭。在另一个实施方案中，所述胰岛素前体的酰基衍生物获得-8的额外负电荷，这可在尿素-PAGE上容易地分析出。在另一个实施方案中，本专利技术的胰岛素(本文所述方法的产物)是Pl值大约6.9的胰岛素-LysArg。在另一个实施方案中，本专利技术的胰岛素-LysArg具有长的体内活性特征。在另一个实施方案中，本专利技术的胰岛素-LysArg具有非常长的体内活性特征。在另一个实施方案中，本专利技术的胰岛素-LysArg具有储库-样(depot-like)特征，因为它在皮下注射之后沉淀。在另一个实施方案中，本专利技术的胰岛素-LysArg缓慢本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备胰岛素的方法，所述方法包括以下步骤：（a）可逆地封闭包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列的Lys‑Arg前体胰岛素中的赖氨酸残基，包括使所述Lys‑Arg前体胰岛素接触包含缓冲液和柠康酸酐的pH6‑10的溶液；和（b）切割所述Lys‑Arg前体胰岛素，包括使步骤(a)的所述Lys‑Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应，从而制备胰岛素。

【技术特征摘要】
1.一种制备胰岛素的方法，所述方法包括以下步骤: (a)可逆地封闭包含SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列的Lys-Arg前体胰岛素中的赖氨酸残基，包括使所述Lys-Arg前体胰岛素接触包含缓冲液和柠康酸酐的pH6_10的溶液；和 (b)切割所述Lys-Arg前体胰岛素,包括使步骤(a)的所述Lys-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应， 从而制备胰岛素。2.权利要求1所述的方法，其中所述使所述Lys-Arg前体胰岛素接触柠康酸酐是在pH9时进行。3.权利要求1所述的方法，其中所述使所述Lys-Arg前体胰岛素接触柠康酸酐是在室温下进行大约I小时。4.权利要求1所述的方法，其中所述使步骤(a)的所述Lys-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应是在pH值为6.0-11.5时进行。5.权利要求1所述的方法，其中所述使步骤(a)的所述Lys-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应是在室温下进行。6.权利要求5所述的方法，其中所述使步骤(a)的所述Lys-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应进行至少5小时。7.权利要求5所述的方法，其中所述使步骤(a)的所述Lys-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应进行23小时。8.权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)之前将所述Lys-Arg前体胰岛素暴露在10.0-11.5 的 pH 值下。9...

【专利技术属性】
技术研发人员：雅各布·哈特曼，江立新，
申请(专利权)人：华凌科技有限公司，
类型：发明
国别省市：以色列;IL