本发明专利技术公开一种基因重组TNF-α衍生物RMP16及其制备方法与应用。通过基因重组得到的RMP16，与天然TNF-α相比，在血液中具有更高的稳定性和生理活性，可显著抑制前列腺癌Du145、淋巴瘤Raji、白血病K562、宫颈癌HeLa、乳腺癌MCF-7等肿瘤细胞的生长，对DU145的抑制效果尤为突出，且可抑制显著Du145细胞移植瘤的生长，其药效学作用与雌莫司汀相似，Du145细胞移植瘤裸鼠，结果显示，重组多肽RMP16的毒副作用明显小于雌莫司汀，无明显的毒副作用表现。该基因重组TNF-α衍生物RMP16可应用于制备具有如下功能的药物：治疗前列腺癌、淋巴瘤、慢性髓原白血病、宫颈癌、乳腺癌等肿瘤。
【技术实现步骤摘要】
基因重组TNF-α衍生物RMP16及其制备方法与应用
本专利技术属于基因工程
，特别涉及一种基因重组TNF-α衍生物RMP16及其制备方法与应用。
技术介绍
TNF-α是较早发现的、研究最为深入的肿瘤坏死因子家族成员之一，抗肿瘤作用强，参与多种生理病理过程的调节。人TNF-α为单拷贝基因，定位在第六号染色体上(6P12-13)，与MHC基因群紧密连锁；TNF-α的cDNA大小约2.76kb，由4个外显子和3个内含子组成。人TNF-α前体由233个氨基酸残基组成，包括由第1、2号外显子编码的76个氨基酸残基的信号肽；切除信号肽后形成非糖基化的成熟的人TNF-α，为157个氨基酸残基，相对分子量为17kDa.。其中第69位和101位为两个半胱氨酸，可形成分子内二硫键，对维持其空间结构有重要意义。TNF-α作为一种蛋白类因子，其生物学活性主要是通过和细胞膜上特异受体结合实现的。TNF-α有两种受体，一种是存在于大部分细胞表面的分子量为55-60kDa.的肿瘤坏死因子受体Ⅰ(tumornecrosisfactorreceptorⅠ，TNFRⅠ)，另一种是主要存在于造血细胞表面的分子量为75-80kDa.的肿瘤坏死因子受体Ⅱ(tumornecrosisfactorreceptorⅡ，TNFRⅡ)。两类TNFR均为跨膜糖蛋白，氨基酸序列分析显示这两种受体的胞外结构域的序列高度相似，都有保守的富含半胱氨酸的同源氨基酸序列；但是胞内结构域却差异很大，TNFRⅠ胞内段含有死亡结构域(deathdomain，DD)，而TNFRⅡ没有DD。TNFRⅠ在大多数种类细胞的表面都表达，且大部分生物学功能是由TNFRⅠ介导，包括杀细胞、抗病毒、诱导ICAM-1及IL-6的表达、促进成纤维细胞增殖、激活NF-κB等。TNFRII主要传递胸腺细胞和NK细胞等淋巴细胞的增殖信号，通过促进TNF-α与TNFRⅠ结合而增加TNFRⅠ诱导的作用。根据细胞及其微环境的不同，激活TNFRⅠ后可通过激活不同的信号途径介导细胞增殖、凋亡、坏死性凋亡等程序。TNF-α具有很好抗肿瘤作用，被认为是最具潜质的癌症治疗药物。但TNF-α在体内易被肾快速排泄和被各种蛋白酶分解，很不稳定，半衰期较短(15-30min)。若希望达到疗效，则必须频繁注射大剂量TNF-α，进而导致严重的不良反应，甚至引起休克死亡。TNF-α的上述缺陷，严重限制了其实际临床应用，研究表明，小分子多肽具有分子量小、活性高、副作用小、无免疫原性、结构简单、易于穿透肿瘤细胞等特点，已成为肿瘤药物研发的新热点。这些都预示着小分子TNF-α衍生物在临床方面将有良好的应用前景。设计高稳定性、高生物活性的TNF-α衍生物，特别是能与血浆中的载体蛋白结合的小分子TNF-α衍生物，可提高其生物利用度，发挥天然TNF-α抗肿瘤的同时，也极大降低了天然TNF-α具有的副作用。具有重要的药用价值和产业化前景。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种基因重组TNF-α衍生物RMP16。该衍生物RMP16具有更高稳定性和更高生物活性。本专利技术的另一目的在于提供所述基因重组TNF-α衍生物RMP16的制备方法。该制备方法根据TNF-α衍生物RMP16的氨基酸序列及大肠杆菌密码子的偏好性，设计RMP16在原核表达系统的基因序列，采用基因工程技术，结合蛋白内含肽(intein)的可诱导剪切功能实现目的多肽RMP16的高效制备；该制备方法生产效率高，生产成本低。本专利技术的再一目的在于提供所述基因重组TNF-α衍生物RMP16的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种基因重组TNF-α衍生物RMP16，其氨基酸序列如下所示：MWQRPSSWIEGRLLTHTISRIAVSYQTKVNLL。编码所述的基因重组TNF-α衍生物RMP16的核苷酸序列为：ATGTGGCAGCGCCCGAGCAGCTGGATTGAAGGTCGCCTGCTGACCCATACCATTAGCCGCATTGCGGTGAGCTATCAGACCAAAGTGAATCTGCTG；所述的基因重组TNF-α衍生物RMP16的制备方法，包括以下步骤：(1)设计并合成RMP16基因：采用3条引物两步法合成RMP16基因：引物F1：5'-GGTGGTCATATGTGGCAGCGCCCGAGCAGCTGGATTGAAGGTCGCCTG-3'；引物F2：5'-GCTCACCGCAATGCGGCTAATGGTATGGGTCAGCAGGCGACCTTC-3'；引物F3：5'-CCACCATGCTCTTCCGCACAGCAGATTCACTTTGGTCTGATAGCTCACCGCAAT-3'；其中，CATATG为NdeⅠ酶切位点，GCTCTTCCGCA为SapⅠ酶切位点；GGTGGT和CCACCAT为保护碱基；首先将引物F1和引物F2进行链延伸反应，然后以其产物为DNA模板，以F1和F3为引物，PCR反应制得RMP16基因；(2)构建重组载体pTXB1-RMP16：用Ndel酶和Sapl酶分别对质粒pTXB1和步骤(1)制得的RMP16基因进行双酶切，再将双酶切后的RMP16基因和双酶切后的质粒pTXB1连接，得到重组载体pTXB1-RMP16；(3)制备表达工程菌pTXB1-RMP16/ER2566：用重组载体pTXB1-RMP16转化表达宿主菌大肠杆菌E.coliStrainER2566，得到表达工程菌pTXB1-RMP16/ER2566；(4)表达和纯化：①诱导表达工程菌pTXB1-RMP16L/ER2566表达由目的多肽、蛋白内含肽和几丁质结合域(Chitinbindingdomain，CBD)组成的“三元”融合蛋白；②得到的“三元”融合蛋白用几丁质柱进行纯化，“三元”融合蛋白吸附于几丁质柱中，然后含有β-巯基乙醇的溶液过柱并充满几丁质柱环境中，反应；β-巯基乙醇的作用是诱导蛋白内含肽的N端切割，释放目的多肽；然后用洗脱几丁质柱的溶液洗柱，收集洗脱液；③利用高效液相色谱技术纯化目的多肽，得到基因重组TNF-α衍生物RMP16。步骤(1)中所述的链延伸反应的条件优选为：94℃，10min；60℃，5min；72℃，10min；步骤(1)中所述的PCR反应的条件优选为：94℃，5min；94℃、30s，60℃、30s，72℃、30s，31次循环；72℃延伸10min；步骤(4)②中所述的含有β-巯基乙醇的溶液的组成如下：20mMTris-HCI，0.5MNaCl，1mMEDTA，50mMβ-巯基乙醇，pH8.0；步骤(4)②中所述的反应的条件优选为23℃反应24小时；步骤(4)②中所述的洗脱几丁质柱的溶液的组成优选如下：20mMTris-HCl，500mMNaCI，1mMEDTA，pH8.0；步骤(4)③中所述的利用高效液相色谱技术纯化目的多肽RMP16的步骤如下：A、流动相A为在体积百分比5％乙腈(CNCH3，溶质为纯水)中添加三氟乙酸(TFA)得到，TFA的终浓度为体积百分比0.1％；流动相B为100％乙腈(CNCH3)中添加三氟乙酸(TFA)，TFA的终浓度为体积百分比0.1％；流速1mL/min，30min线性梯度洗脱；B、线性本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基因重组TNF‑α衍生物RMP16，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种基因重组TNF-α衍生物RMP16，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的基因重组TNF-α衍生物RMP16，其特征在于：编码所述的基因重组TNF-α衍生物RMP16的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.权利要求1或2所述的基因重组TNF-α衍生物RMP16的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)设计并合成RMP16基因：采用3条引物两步法合成RMP16基因：引物F1：5'-GGTGGTCATATGTGGCAGCGCCCGAGCAGCTGGATTGAAGGTCGCCTG-3'；引物F2：5'-GCTCACCGCAATGCGGCTAATGGTATGGGTCAGCAGGCGACCTTC-3'；引物F3：5'-CCACCATGCTCTTCCGCACAGCAGATTCACTTTGGTCTGATAGCTCACCGCAAT-3'；其中，CATATG为NdeⅠ酶切位点，GCTCTTCCGCA为SapⅠ酶切位点；GGTGGT和CCACCAT为保护碱基；首先将引物F1和引物F2进行链延伸反应，然后以其产物为DNA模板，以F1和F3为引物，PCR反应制得RMP16基因；(2)构建重组载体pTXB1-RMP16：用Ndel酶和Sapl酶分别对质粒pTXB1和步骤(1)制得的RMP16基因进行双酶切，再将双酶切后的RMP16基因和双酶切后的质粒pTXB1连接，得到重组载体pTXB1-RMP16；(3)制备表达工程菌pTXB1-RMP16/ER2566：用重组载体pTXB1-RMP16转化表达宿主菌大肠杆菌E.coliStrainER2566，得到表达工程菌pTXB1-RMP16/ER2566；(4)表达和纯化：①诱导表达工程菌pTXB1-RMP16L/ER2566表达由目的多肽、蛋白内含肽和几丁质结合域组成的“三元”融合蛋白；②得到的“三元”融合蛋白用几丁质柱进行纯化，“三元”融合...
【专利技术属性】
技术研发人员：马义，洪岸，姜石松，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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