一种基因重组人抗菌肽ｍｈＣＡＰ－１８的活性ＧＳＬＬ－３９片段，其特征是所述的ｍｈＣＡＰ－１８包含１４６个氨基酸或其活性片段，编译ｍｈＣＡＰ－１８的ｃＤＮＡ序列包含４４１个核苷酸碱基或其改构体；ｍｈＣＡＰ－１８在体外经凝血酶酶切得到重组人抗菌肽活性ＧＳＬＬ－３９片段，ＧＳＬＬ－３９的氨基酸序列为：ＧＳＬＬＧＤＦＦＲＫＳＫＥＫＩＧＫＥＦＫＲＩＶＱＲＩＫＤＦＬＲＮＬＶＰＲＴＥＳ。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因重组工程，尤其是利用原核系统表达基因重组人抗菌肽mhCAP-18的活性GSLL-39片段及其制备方法和用途。
技术介绍
天然免疫是机体抵抗病原微生物入侵的第一道屏障，抗微生物肽(antimicrobial peptide)又称多肽抗生素(peptide antibiotics)，是一类机体自身表达的具有抗微生物活性的小肽，是机体天然免疫的重要组成部分，它们对格兰氏阳性、阴性细菌、真菌、病毒等都有杀伤作用；抗微生物肽以结构和氨基酸基序分类，人类抗微生物肽可分为防御素(defensin)、cathelicidin和histatin三类。cathelicidin分子由保守的cathelin样结构域和特异的C末端结构组成，在哺乳动物中已发现三十余种，但目前仅发现一种人类cathelicidin，hCAP-18/LL-37。该基因位于3号染色体，有4个外显子，最早由人类骨髓cDNA文库中筛选出(原称FALL-39)，编码由170个氨基酸组成的多肽，其中30个氨基酸为信号肽，其余140个氨基酸编码分子量为18kD的前体，人类阳离子抗微生物蛋白，hCAP-18(human cationic antimicrobial protein18)。hCAP-18分子是LL-37的前体蛋白，由cathelin样结构域和LL-37结构域构成，cathelin样结构域结合并中和LL-37结构域的活性，因此hCAP-18分子本身没有抗微生物活性；丝氨酸蛋白酶3从丙氨酸103和亮氨酸104间酶切，将其C末端包含37个氨基酸的肽段切下，形成成熟、有活性的抗微生物肽，由于它N端头两个氨基酸均为亮氨酸(L)，因此将其命名为LL-37。LL-37有多种生物学特点1)广谱抗微生物活性对格兰氏阳性、阴性细菌，真菌等微生物有抗微生物活性；2)趋化活性对肥大细胞、中性粒细胞、单核细胞、T细胞等有趋化作用(chemotactic)；3)免疫调节活性可上调多种趋化因子和趋化因子受体的表达；4)中和内毒素结合并中和LPS，阻止LPS结合到CD14+细胞上，防止由格兰氏阴性细菌感染引起的内毒素休克；5)促进血管新生；6)抗降解与其它α螺旋抗微生物肽不同，在溶液中可形成多聚体形式，从而防止了被蛋白酶降解。LL-37分子氨基酸序列为LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES，呈两性α螺旋空间构象，即α螺旋的一侧集中了亲水氨基酸，是亲水区，另一侧集中了疏水氨基酸，是疏水区；正是由于这种特殊的空间构象，决定了LL-37可插入并通过地毯样机制(carpet-like mechanism)破坏细胞膜，使之通透性发生改变，最终导致细胞死亡。LL-37分子中间E11-V32部分多肽(11EKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLV32)是两性α螺旋的核心，N端和C端其它氨基酸对特异空间构象和抗微生物活性贡献很小。LL-37在中性粒细胞、睾丸和表皮细胞中呈组成性表达，角质细胞在炎症时可诱导表达；在表皮、口腔、呼吸道、胎儿、新生儿的天然免疫中起重要作用；本专利技术人的研究发现LL-37在部分白血病细胞系及新鲜白血病患者骨髓、外周血标本也有表达，但表达水平低于正常人。LL-37表达低下与牛皮癣、湿疣刺、寻常疣、慢性鼻炎、特异性皮炎、肺囊性纤维化、细菌性痢疾、Morbus Kostman(MK)等多种疾病相关；此外，LL-37还可用于中和LPS，预防、治疗格兰氏阴性细菌引起的感染性休克等，因此，重组LL-37有巨大的应用潜力。采用基因工程技术在原核系统表达外源蛋白是目前生物医学工程的常用手段，但由于LL-37本身的抗微生物特性，因此不能在原核体系中直接表达有抗微生物活性的LL-37。在原核系统表达重组蛋白是目前常用的手段，具有周期短、成本低、易于大规模生产等特点，目前在科研中使用的LL-37多为通过多肽合成，成本高。由于LL-37有抗菌活性，因此不能在原核系统中直接表达有活性的LL-37；同时由于体内将hCAP18酶切形成活性LL-37的蛋白酶成本高，不适于大规模生产，因此也不宜通过表达hCAP18获得LL-37。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种在原核体系中表达hCAP-18的方法，通过同时表达hCAP-18的cathelin样结构域和LL-37结构域，并在两个结构域间加入凝血酶酶切位点，成功表达没有抗微生物活性的改造后的mhCAP-18，再经体外酶切、纯化，可获得具有抗微生物活性的重组GSLL-39。GSLL-39与药物学可接受的其它药物组合物，所述药物组合物可给予人以预防、治疗hCAP-18/LL-37相关的各种疾病。为了解决上述问题，本专利技术采用的技术方案是一种基因重组人抗菌肽mhCAP-18的活性GSLL-39片段，所述的mhCAP-18包含146个氨基酸或其活性片段，编译mhCAP-18的cDNA序列包含441个核苷酸碱基或其改构体；mhCAP-18在体外经凝血酶酶切得到重组人抗菌肽活性GSLL-39片段，GSLL-39的氨基酸序列为GSLLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES。基因重组人抗菌肽mhCAP-18的活性GSLL-39片段的制备方法，包括a.利用原核细胞生产含凝血酶酶切位点的人抗菌肽mhCAP-18；b.利用凝血酶酶切含凝血酶酶切位点的人抗菌肽mhCAP-18，获得重组人抗菌肽活性GSLL-39片段。所述的原核细胞为大肠杆菌。所述的利用原核细胞生产基因重组含凝血酶酶切位点的人抗菌肽mhCAP-18包括以下步骤a.根据hCAP-18/LL-37的基因序列设计PCR引物进行反转录PCR扩增，获得表达hCAP-18/LL-37的基因片段，然后根据hCAP-18/LL-37分子cathelin样结构域、LL-37结构域构和凝血酶酶切位点序列再设计PCR引物，采用Overlap PCR进行扩增，获得表达含凝血酶酶切位点的人抗菌肽mhCAP-18的基因片段，通过双酶酶切，定向克隆到原核表达载体中，构建表达载体，并转化大肠杆菌成为工程菌；b.重组含凝血酶酶切位点的人抗菌肽mhCAP-18的纯化诱导后的工程菌，经超声破碎细菌后离心取上清，再经过层析的方法；c.活性人抗菌肽GSLL-39的纯化经纯化的重组含凝血酶酶切位点的人抗菌肽mhCAP-18在体外经凝血酶酶切，再经SP离子交换层析及除菌、浓缩和冻干。所述的原核表达载体是pET系列载体表达系统、T7表达系统、pBAD表达系统、pTrc表达系统、PurePro Caulobacter表达系统、PL表达系统中的一种。所述的双酶酶切是通过NcoI和EcoRI双酶切位点，所述的原核表达载体是pET32c(+)，构建的表达载体为pET-mhCAP-18。所述的层析方法是Ni2+鏊合层析。所述的GSLL-39片段用于预防或治疗hCAP-18/LL-37相关疾病。所述的hCAP-18/LL-37相关疾病选自感染性疾病、皮肤损伤修复或格兰氏阴性细菌引起的感染性休克。应用途径包括雾化、外涂、外敷、浸泡的外用，肌肉注射，皮下注射，皮内注射，静脉注射或口服。本专利技术在Cathelin结构域与LL-37结构域之间引入凝血酶的切割位点，使mhCA本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴克复，郑国光，杨应华，李戈，饶青，
申请(专利权)人：中国医学科学院血液学研究所，
类型：发明
国别省市：
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