脱酰胺基干扰素-β制造技术

按照天然干扰素－β编号的２５位天冬酰胺脱酰胺基的干扰素－β类似物显示的天然人干扰素－β生物学活性升高并且无需ＨＡ来稳定蛋白质。脱酰胺基产物适合于大规模生产，可用于掺入含ＨＡ或不含ＨＡ的治疗剂以治疗包括多发性硬化症在内的疾病。内切蛋白酶－Ｃ肽图技术能利用酶学消化，然后采用ＲＰ－ＨＰＬＣ得到蛋白质指纹分布图，该技术也可作为脱酰胺基产物的ＩＤ和／或定量测定检验而用于质控。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术总体处于生物学活性蛋白质化学领域。更具体地说，本专利技术涉及因半胱氨酸、天冬酰胺和其它残基的取代、缺失或修饰而不同于天然蛋白质的突变和化学改变的干扰素β类似物。2.
技术介绍
发现干扰素β能用于治疗人类疾病，包括多发性硬化症。多发性硬化症(MS)是在环绕神经纤维的保护性鞘破坏时发生的一种中枢神经系统慢性疾病，其往往致残。约30％的MS患者具有复发-缓解形式的该疾病，在该形式中症状在发作后可完全或部分消失，然后是持续数月或数年的稳定期。已证实给予β干扰素(干扰素-β或IFN-β)能降低MS发作的频率。因此，干扰素-β药物成为控制和治疗MS的重要工具。已开发了重组DNA(rDNA)技术来促进大规模生产干扰素-β药物。这些技术特别需要解决的问题是人β干扰素(其氨基酸序列见图1(SEQ ID NO1))在17、31和141位含有半胱氨酸残基(Gene，(1980)，1011-15和Nature，(1980)，285542-547)，这些残基中至少一些对其活性不重要，但能随意形成不希望的分子间或分子内连接。在采用rDNA技术进行IFN-β的微生物制备过程中，观察到在含有高浓度的IFN-β的提取物中因分子间连接而形成IFN-β的二聚体和寡聚体。形成这种多聚体使得IFN-β的纯化和分离费力费时，在纯化和分离过程中需要数个额外步骤，例如在纯化过程中还原蛋白质，再氧化使其恢复其原始构象，从而可能增加不正确二硫键的形成。此外，该多聚体与低特异性生物学活性相关。为解决此问题，开发了精细rDNA技术改变微生物产生的生物学活性IFN-β蛋白质类似物，所述技术对蛋白质类似物活性没有不利影响但能降低或消除它们形成分子间交联或分子内键从而使得蛋白质采取不良四级结构(例如，降低蛋白质活性的构象)的能力。已成功地采用定向诱变技术来形成突变(方式)改变的生物学活性蛋白质类似物(本文用“蛋白质类似物”指其中一个或多个氨基酸经遗传和/或化学修饰并保留母体蛋白质的生物学活性的合成蛋白质)，所述类似物保留了其母体蛋白质的所需活性但缺乏形成分子间交联或不良分子内二硫键的能力。发现17位的半胱氨酸残基缺失或被另一氨基酸取代的IFN-β生物学活性蛋白质的合成蛋白质类似物具有所需活性和特征。具体地说，干扰素-β1b(IFN-β1b)是IFN-β的一种合成重组蛋白质类似物，其是17位的半胱氨酸残基被丝氨酸残基取代的生物学活性蛋白质。作为微生物产生的蛋白质，IFN-β1b是非糖基化的。其也具有N-末端甲硫氨酸缺失。IFN-β1b已配制为显示能有效治疗和控制MS的成功药物，以Betaseron投入市场。以下许多美国专利和申请描述了此蛋白质类似物、用于其制备的材料和技术、其作为治疗剂的制剂及其治疗MS的应用并要求了权益1982年10月19日提交的申请号435,154；1986年5月13日授权的专利号4,588,585；1988年4月12日授权的专利号4,737,462；和1990年9月25日授权的专利号4,959,314；各份文献有关这些特征的内容纳入本文作为参考。也从哺乳动物来源，特别是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞进行了用作药物的IFN-β大规模生产。称为IFN-β1a的此IFN-β类似物不具有IFN-β1b的Ser17突变，而且是糖基化的。IFN-β1a配制为治疗性产品，以Avonex和Rebith投入市场。对于大多数治疗剂，不断需要鉴定和生产更有效的生物学活性药物。以IFN-β药物为例，需要生物学活性增加的IFN-β类似物。此外，一些IFN-β药物制剂(包括Betaseron)含有人白蛋白(HA或HSA)，一种常规的蛋白质稳定剂。HA是人血产品，其供应量日益下降。因此，近年来需要不含HA的药物制剂，最好是稳定和有效的不含HA的IFN-β制剂。专利技术概述本专利技术通过使干扰素-β脱酰胺基解决了这些需求。脱酰胺基IFN-β是其25位(根据天然干扰素-β编号)的天冬酰胺脱酰胺基的人干扰素-β蛋白质类似物。脱酰胺基产物显示的天然人干扰素-β的生物学活性水平升高且无需HA来稳定蛋白质。在一具体的实施方案中，脱酰胺基IFN-β是合成的人干扰素-β1b蛋白质类似物，其17位(根据天然干扰素-β编号)半胱氨酸缺失或为中性氨基酸，特别是丝氨酸取代，其25位天冬酰胺脱酰胺基从而形成环状酰亚胺、天冬氨酸或异天冬氨酸残基。与其IFN-β母体蛋白质相比，脱酰胺基的产物显示所需的天然人干扰素-β的生物学活性(例如，细胞病变效应或抗增殖活性，例如显示与多发性硬化症发作频率降低相关)水平升高。此外，在该蛋白质类似物的不含HA制剂中观察到生物学活性升高。也提供了治疗性组合物中活性蛋白质类似物化合物的制剂及制备和使用方法。此外，提供了内切蛋白酶-C肽图技术，该技术在较低pH时对还原的蛋白质样品进行酶消化，然后层析分辨肽片段以得到蛋白质的指纹分布图，该技术可作为脱酰胺基产物的ID检验而用于质控。阅读以下专利技术详述结合附图可更全面地了解本专利技术的这些和其它目的及特征。 附图说明图1是IFN-β的氨基酸序列。图2是IFN-β1b的氨基酸序列，其表明本专利技术脱酰胺基的位点和性质。图3参考本专利技术INF-βAsn25脱酰胺基说明Asn脱酰胺基途径。图4-11显示了本专利技术一方面的各种不含HA的IFN-β稳定性药物和产品批次中脱酰胺基IFN-β1b的效力与含量的图。图12A显示了本专利技术一方面的不含HA的IFN-β稳定性样品的Glu-C肽图。图12B显示了图12A的一部分的放大图。图13显示了不含HA的IFN-β对照样品的RP-HPLC分布情况(时间(分钟)与应答(mV))。图14显示了本专利技术一方面的不含HA的IFN-β1b药物产品批次稳定性样品的RP-HPLC分布情况。图15是本专利技术一方面的不含HA的IFN-β稳定性样品的RP-HPLC级分(fraction)的CPE活性图。图16A显示了本专利技术一方面的不含HA的IFN-β稳定性样品的RP-HPLC级分对Hs294T的抗增殖活性结果。图16B显示了本专利技术一方面的不含HA的IFN-β稳定性样品的RP-HPLC级分对Daudi的抗增殖活性结果。本专利技术具体实施方案描述现在将参考数个实施方案描述本专利技术的化合物、组合物、物质和相关的技术及应用。教材的结构中说明了所述实施方案的重要特性和特征。尽管结合这些实施方案描述了本专利技术，但应该知道本专利技术不限于这些实施方案。相反，应涵盖包含在附加的权利要求所确定的本专利技术构思和范围内的改变形式、改进形式和等价形式。为全面理解本专利技术，以下描述给出了许多具体细节。本专利技术的实施可不利用这些具体细节中的某些或全部。在其它情况中，未详细描述熟知的过程操作以免不必要地混淆本专利技术。引言本专利技术提供脱酰胺基干扰素-β。脱酰胺基IFN-β是其中25位(根据天然干扰素-β编号)的天冬酰胺脱酰胺基的人干扰素-β蛋白质类似物。Asn经环状酰亚胺中间体脱酰胺基为Asp或异-Asp。脱酰胺基产物显示的天然人干扰素-β的生物学活性水平升高且无需HA来稳定蛋白质。也提供了治疗性组合物中的活性蛋白质类似物化合物的制剂及其制备和使用方法。本文用“蛋白质类似物”指合成蛋白质，其中一个或多个氨基酸经遗传和/或化学修饰并且保留了母体蛋白质的生物学活性，例如致细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纯化和分离的合成人干扰素－β蛋白质类似物，其中　　　　按照天然干扰素－β编号的第２５位的天冬酰胺被脱酰胺基，和　　　　所述蛋白质类似物显示天然人干扰素－β的生物学活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：古谷健二，D约翰逊杰克逊，DT鲁斯西奥，
申请(专利权)人：诺华疫苗和诊断公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]