本发明专利技术公开了一种定点突变的人胰岛素原基因及其腺病毒重组载体，（１）ＲＴ－ＰＣＲ方法从正常流产胎儿胰腺组织获取野生型人胰岛素原ｃＤＮＡ；（２）重叠延伸ＰＣＲ方法在人胰岛素原ｃＤＮＡ上制造两个突变位点，以使其可以被蛋白酶Ｆｕｒｉｎ切割成熟，该突变型胰岛素原ｃＤＮＡ片段命名为胰岛素－Ｍ２（ＩＮＳ－Ｍ２）；（３）将ＩＮＳ－Ｍ２克隆至腺病毒载体系统的穿梭载体的多克隆位点（Ｈｉｎｄ Ⅲ和ＸｈｏⅠ）上，并与骨架载体共转染至ＢＪ５１８３细菌内，通过细菌内同源重组得到重组载体。本发明专利技术使人胰岛素原基因在非β细胞内可以表达为成熟的胰岛素分泌出来成为可能，为高效的转染处于非分裂期的细胞奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物遗传领域，尤其是用于治疗糖尿病的定点突变的人胰 岛素原基因及其腺病毒重组载体。
技术介绍
目前糖尿病已成为仅次于心脑血管病症和癌症的第三大死亡疾病，据WH0统计，全民糖尿病患者已接近1.5亿，我国目前糖尿病患者的总数已达 到5000万人。它是一种影响体内胰岛素和糖含量的疾病，共有两种主要类 型，分别为I型和II型，其共同特征是胰岛P细胞损伤或不能产生足够 的胰岛素或机体不能有效的利用胰岛素，所以胰岛素就被作为治疗糖尿病 的特效药应用于临床。由于随时需要注射胰岛素，给患者带来了极大的不 便，目前国际上对糖尿病进行胰岛移植和基因治疗研究成为了热点。在I型糖尿病中，免疫系统被误导，对分泌胰岛素的胰腺细胞发动攻 击导致调控糖代谢的胰岛素水平降低甚至不复存在。I型糖尿病病人必须每 天注射胰岛素才能维持生命。II型糖尿病的发病机制较复杂，与多种因素 相关，身体不能生成足够的胰岛素或者不能有效利用胰岛素。目前的治疗 主要着眼于改善机体的胰岛素敏感性，纠正代谢紊乱，其基因治疗报道甚 少。如果糖尿病患者不能适当地控制其血糖水平，则可能产生严重的并发 症，包括心脏病、肾衰、失明和神经损伤。胰岛素主要用于i型糖尿病和口服降糖药不理想及严重并发症的n型糖尿病的治疗，其作为糖尿病的特效药用于临床已有70多年的历史。但是 由于胰岛素半衰期短，糖尿病患者随时需要注射胰岛素，给患者带来了极 大痛苦和不便，虽然口服胰岛素和长效胰岛素在某种程度上有所进步，但 是未能从根本上解决问题。研究者们就把目光转向了对糖尿病患者进行胰 岛移植和基因治疗。胰腺或胰岛移植被认为是治愈I型糖尿病的有效手段， 但是供体来源不足、自身免疫排斥反应、供体存活率低和代价昂贵等问题 限制了这一疗法的广泛应用。而基因治疗恰恰可避免上述缺陷，它是通过 将胰岛素基因导入不受自身免疫攻击的非P细胞，使之表达胰岛素，行使代替P细胞的功能，从而达到从根本上治愈I型糖尿病的目的。随着分子生物学领域取得的迅猛发展，特别是随着基因重组和转基因 技术的发展，使基因治疗糖尿病成为可能。基因治疗糖尿病目前存在的两 个主要问题，S卩胰岛素原基因在非e细胞中不能表达为成熟的胰岛素； 选择什么样的安全有效的载体系统。研究发现，只有胰岛P细胞含有特定 前激素转化酶(PC2和PC3)，可以把人胰岛素原合成为成熟的具有生理活性 的胰岛素A链和B链复合体。而非P细胞不含这类酶，研究者们直接将人 胰岛素原基因转染到其中，并不能合成成熟的胰岛素。但在大多数非3细胞内普遍表达furin蛋白酶，它的底物是Arg Thr Lys Arg或Arg Gin Lys Arg。在C肽的两端进行定点突变，使其成为furin蛋白酶的底物。另外， 对于选择安全有效的载体系统，腺病毒载体是在基因治疗、基因免疫等方 面应用开发得较早的一种基因载体，在美国近三分之一的基因治疗临床试 验中采用腺病毒载体。这些腺病毒载体现在正在被评估作为载体对癌症、 心血管疾病和遗传紊乱等病人进行基因治疗的安全性和有效性。根据美国 国家卫生院的生物技术活动办公室统计，在过去的20年里，己进行了将近 144例使用腺病毒载体的基因治疗临床试验，在所有参与基因治疗临床试验 的病人中，将近五分之一己引入了腺病毒载体。研究者们把定点突变的人 胰岛素原基因构建到真核表达载体(如pcDNA3. 1、 p (G1RE) 3BP-1、 p EF1 a-GFP等)或逆转录病毒载体(pLNCX、 PLXSN等)中，但是这些真核表达 载体只能转染处于分裂期的细胞，对于非分裂期的细胞它们的转染效率非 常的低；而逆转录病毒载体使用起来不安全，它们转染宿主细胞后要整合 到宿主细胞的基因组中，极有可能引起致癌基因的激活。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是将野生型人胰岛素原基因进行定点突变，然后将其构建到腺病毒载体系统pAdEasy-l中，为进一步转染非胰岛 e细胞，对糖尿病进行基因治疗奠定基础。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是(1) RT — PCR方 法从正常流产胎儿胰腺组织获取野生型人胰岛素原cDNA ; (2)重叠延伸 PCR方法在人胰岛素原cDNA上制造两个突变位点，以使其可以被蛋白酶 Furin切割成熟，该突变型胰岛素原cDNA片段命名为胰岛素一M25(INS-M2) ; (3)将INS-M2亚克隆至腺病毒载体系统的穿梭载体的多克隆 位点(Hind III和XhoI)上，并与骨架载体共转染至BJ5183细菌内，通过 细菌内同源重组得到重组载体。一种定点突变的人胰岛素原基因，通过重叠延伸PCR方法在人胰岛素 原cDNA上制造两个突变位点163-164和263位点，使其被蛋白酶Fur in切 割成熟，获得定点突变的人胰岛素原基因。人胰岛素原cDNA的碱基序列为SEQ ID NO. 1，经过两个突变位点获得 定点突变的人胰岛素原基因的碱基序列为SEQ ID NO. 3，命名为INS-M2。一种定点突变的人胰岛素原基因腺病毒重组载体，将INS-M2亚克隆至 腺病毒载体系统的穿梭载体的多克隆位点Hind III和Xhol上，并与骨架载 体共转染至BJ5183细菌内，通过细菌内同源重组得到重组载体。将腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV和突变型人胰岛素原基因頂S—M2分 别用HindIII和Xhol双酶切，纯化、回收双酶切产物进行连接，连接产物 命名为pAdtrack-INS-M2; pAdtrack-INS-M2质粒经Pmel酶线性化、去磷 酸化，以回收的CIAP处理的线性化pAdtrack-INS-M2质粒转化常规氯化钙 方法制备的BJ5183pAdEasier-1感受态细胞，接种于卡那霉素的LB培养基 内，获得定点突变的人胰岛素原基因腺病毒重组载体，命名为pAd-INS-M2， 构建策略见图6。腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV和突变型人胰岛素原基因INS—M2进行 连接反应条件为INS—M2双酶切产物5y 1、pAdtrack-CMV双酶切产物3u 1、 Buffer lul、 T4 DNA连接酶ltil， 16°C 16h。pAdtrack-INS-M2质粒经Pmel酶线性化的条件是pAdtrack-INS-M2 质粒2ug，尸/ffe/ 1U， 10 X NEB buff er4 5uL， 100 XBSA 0. 5 u L，补足 去离子水至总体积50uL， 37。C水浴4小时，95度水浴10分钟，Takara胶 回收试剂盒纯化回收。线性化质粒的去磷酸化的条件是线性化的pAdtrack-頂S-M2质粒 lug， 10 XCIAP buffer 5yL， CIAP 1U，补足去离子水至总体积50 u L， 37t:水浴4小时，65度水浴30分钟灭活CIAP，赛百盛小量胶回收试剂盒 浓縮回收。以回收的CIAP处理的线性化pAdtmck-INS-M2质粒转化常规氯化转方6法制备的BJ5183pAdEasier-1感受态细胞，铺卡那霉素抗性的LB平板，37 t:孵箱倒置培养14 16小时，挑选数个体积最小的卡那霉素抗性菌落，接 种于3mL含有50 u g/mL卡那霉素的LB培养基内，37°C中速振荡培养过夜。 本专利技术的有本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种定点突变的人胰岛素原基因，其特征在于，通过重叠延伸ＰＣＲ方法在人胰岛素原ｃＤＮＡ上制造两个突变位点１６３－１６４和２６３位点，使其被蛋白酶Ｆｕｒｉｎ切割成熟，获得定点突变的人胰岛素原基因。
【技术特征摘要】
1、一种定点突变的人胰岛素原基因，其特征在于，通过重叠延伸PCR方法在人胰岛素原cDNA上制造两个突变位点163-164和263位点，使其被蛋白酶Furin切割成熟，获得定点突变的人胰岛素原基因。2、 根据权利要求l所述的定点突变的人胰岛素原基因，其特征在于， 人胰岛素原cDNA的碱基序列为SEQ ID NO. 1，经过两个突变位点获得定点 突变的人胰岛素原基因的碱基序列为SEQ ID NO. 3，命名为INS-M2。3、 一种定点突变的人胰岛素原基因腺病毒重组载体，其特征在于，将 INS-M2亚克隆至腺病毒载体系统的穿梭载体的多克隆位点Hind III和Xhol 上，并与骨架载体共转染至BJ5183细菌内，通过细菌内同源重组得到重组 载体。4、 根据权利要求3所述的定点突变的人胰岛素原基因腺病毒重组载体， 其特征在于，将腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV和突变型人胰岛素原基因INS 一M2分别用HindlII和XhoI双酶切，纯化、回收双酶切产物进行连接，连 接产物命名为pAdtrack-INS-M2; pAdtrack-頂S-M2质粒经Pmel酶线性化、 去磷酸化，以回收的CIAP处理的线性化pAdtrack-INS-M2质粒转化常规氯 化钙方法制备的BJ5183pAdEasier-1感受态细胞，接种于卡那霉素的LB培 养基内，获得定点突变的人胰岛素原基因腺病毒重组载体，命名为 pAd-INS-M2，构建策略见图6。5、 根据权利要求4所述的定点突变的人胰岛素原基因腺病毒重组载体， 其特征在于，腺病毒穿梭质粒p...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩忠朝，石琳，
申请(专利权)人：中国医学科学院血液学研究所，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]
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