基于人体自身分泌的新型抗菌活性肽制造技术

本发明专利技术实施例公开了一类基于人体自身分泌的新型抗菌活性肽，是以人体自身分泌的SPLUNC1蛋白为模版，结合活性肽(AMP)分子设计与合成理论、生物进化保守基因原理，基于抗菌的模式序列需求、优势位点的氨基酸结构及其残基结构修饰开展新型抗菌肽的组合设计，采用成熟的多肽合成技术制备。每种AMP长度仅为原SPLUNC1蛋白的十分之一，并且合成简单、成本低廉。新合成的AMP来源于人体高度保守的氨基酸序列，具有高度的生物稳定性和适当的半衰期。经体外实验证实新合成的AMP具有较好的水溶性、广谱的抗细菌、真菌作用，几乎不产生溶血，有望开发成为新的抗菌临床药物。

【技术实现步骤摘要】
基于人体自身分泌的新型抗菌活性肽
本专利技术属于生物化学
，具体涉及一类基于人体自身分泌的新型抗菌活性肽。
技术介绍
自从抗生素专利技术以来，人类在控制和治疗微生物感染中取得了较大的成就。但是随着抗生素的持续使用，目前微生物耐药性已成为临床微生物感染控制的重大问题，以至于缺乏抑制或杀灭某些微生物细菌的一线药物。在临床药物治疗中，出现了耐万古霉素的葡萄球菌、肠球菌，产超广谱β内酰氨酶的革兰氏阴性菌等，严重威胁人类健康。因此，开发具有新型抗菌机制的抗菌药物是解决抗生素耐药性的重要途径。抗菌肽(Antimicrobialpeptides，AMP)是指有机体在真核生物的核糖体和原核生物非核糖体合成的小分子碱性多肽，也是一类具有巨大发展潜力的新型抗菌药物。由基因编码、核糖体合成的抗菌肽是宿主先天性免疫防御系统产生的一类抵抗外界病原体感染的小分子阳离子肽类生物活性物质，是先天性免疫的重要效应分子。天然生物抗菌肽抗菌谱广，特别是对多重耐药菌具有杀伤作用，而且抗菌肽热稳定性和水溶性好，对高等动物的正常细胞几乎无毒害作用。因此，抗菌肽成为国内外研究和开发的热点，天然生物抗菌肽的开发利用有望成为人类摆脱“耐药菌危机”的又一新途径。从20世纪末开始，抗菌肽的研究得到了快速发展，大量抗菌肽不断从动物、植物、昆虫中分离获得。研究表明，抗菌肽是低等生物防御系统的共同特征。但是来源于动、植物、昆虫的AMP或由于其本身的毒性作用，或由于蛋白质的异源性引起的免疫损伤，对人体有较大的损害，很难应用于临床。最近研究表明，哺乳动物上皮组织也含有抗菌肽。短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1(shortpalatelungandnasalepitheliumclonel，SPLUNCl)是一种新发现的高表达于呼吸道上皮的蛋白分子，包括256个氨基酸。有关SPLUNC1蛋白的研究表明SPLUNC1蛋白的N端含有19个氨基酸的信号肽，证明SPLUNC1蛋白可能为一种分泌性的蛋白质，同时在其结构中含有一个杀菌细菌渗透增强蛋白(BPI)的结构域,BPI三维结构的N端的桶状结构形成了一个极性的疏水性的口袋，能结合磷酸卵磷酯和革兰氏阴性细菌脂多糖的酰基，阻止脂多糖(LPS)和脂多糖结合蛋白(LBP)的结合，并将LPS传递至吞噬细胞使其降解，使得BPI成为杀革兰氏阴性细菌和抑制LPS诱导的致炎因子产生的重要的决定者。研究显示SPLUNC1也具有潜在的结合细菌脂多糖的功能，具有抑制铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、霍乱弧菌、支原体、EB病毒等作用。SPLUNC1蛋白在维持上呼吸道免受外来菌的侵袭中起着决定性的作用，是一种能维持上呼吸道细菌稳态的关键分子。由于SPLUNC1蛋白包含的AA序列多达256个，分子质量大，提取或人工合成成本昂贵，易于被体内的蛋白水解酶作用，影响了其作为潜在AMP的应用。利用已有的AMP进行修饰和改造，从而增强原有AMP的抗菌活性、降低生物毒性、扩大AMP的应用范围，成为专利技术新的抗菌肽的有效手段。当前应用最广泛的方法主要有：(1)基于天然抗菌肽模板的序列修饰；(2)螺旋轮方法；(3)序列模板方法；(4)组合肽库方法；(5)基于分子模拟的全新设计。但是这些方法均基于天然抗菌肽的结构，尽管能够改善其某些方面存在的缺陷，所设计分子存在结构多样性不足的问题；组合肽库方法虽然能很好的满足分子多样性要求，并可实现抗菌肽的高通量筛选，但实验需要消耗大量人力、物力、财力；基于分子模拟的全新设计可以实现抗菌肽的虚拟设计与高效筛选，并能在理论上阐释抗菌肽在体内的作用机制，但该方法主要用于抗菌肽与细胞膜的作用机理研究，而且计算量相对较大。因此基于天然抗菌肽发现分子量更小的短肽，通过截取抗菌肽的部分氨基酸并用非天然氨基酸改造，提高抗菌活性与成药性、降低化学合成难度以及规模化生产成本、加快产业化进程，是当前抗菌肽改造的发展趋势。
技术实现思路
本专利技术的目的就是综合序列模板方法、螺旋轮方法、序列修饰方法，应用生物信息学技术，以人体自分泌的SPLUNC1蛋白为模版，结合AMP分子设计与合成理论、生物进化保守基因原理，基于抗菌的模式序列需求、优势位点的氨基酸结构及其残基结构修饰开展新型抗菌肽的组合设计，制备结构特异性好、体内抗酶解能力强、作用机理明确、毒副作用小、化学合成容易、成药潜力优异的小分子抗菌活性肽，并将此新型抗菌活性肽应用到治疗感染性疾病、真菌性疾病中。本专利技术提供的基于人体自身分泌的新型抗菌活性肽的氨基酸序列如下：AMP1：NLPLLDILKPGGGTSGGLLGGLLGKVTSVIPG；AMP2：AVRDKQHRIHLVLGDCTHSPGSLQISL；AMP3：PIQGLLDSLTGILNKVLPHLVQGNVCPLVNHVLRGL。上述新型抗菌活性肽，其中，所述活性肽AMP1、AMP2、AMP3的核心区域分别位于SPLUNC1蛋白的70-101、165-191、199-234AA序列段。上述基于人体自身分泌的新型抗菌活性肽在治疗感染性疾病、真菌性疾病中应用。本专利技术的基于人体自身分泌的新型抗菌活性肽的技术方案如下：(1)基于天然抗菌肽SPLUNC1蛋白一级序列的保守残基分析和杀菌细菌渗透增强蛋白(BPI)结构域的分析，通过比对不同生物种SPLUNC1蛋白差异性AA序列，确定人源性SPLUNC1蛋白抗菌肽核心序列的优势位点及优势氨基酸；(2)基于现有的生物酶切位点数据库，推测SPLUNC1蛋白在生物体内可能存在的全部AA残基序列；(3)根据抗菌肽的阳离子性与两亲性特征，初步排除可能没有活性的抗菌肽，筛选出特定的多肽片段；(4)应用专业软件程序，对筛选出的多肽片段进行理化性质与功能的预测，主要包括多肽片段的电荷、疏水性、螺旋、跨膜结构、半衰期、等电点、分子质量、分子式；(5)使用AMP理论预测模型预测理论设计抗菌肽的抗菌活性，并通过对关键位点AA的替换增强新设计的AMP的生物学活性；(6)对新设计的AMP进行固相合成、纯化与鉴定；(7)测定新设计的抗菌肽对多种革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的抗菌活性，验证设计的可靠性，评价筛选多肽的抗菌能力与抗菌谱；(8)抗菌肽的溶血活性实验研究，评价其安全性与成药性。采用成熟的多肽合成技术合成本专利技术的基于人体自身分泌的新型抗菌活性肽的合成路线如下：本专利技术基于抗菌肽的研究现状，将生物信息学、化学信息学与生物化学有机结合，以人体自身分泌的SPLUNC1蛋白为模版，基于抗菌肽的阳离子性与两亲性结构特征、模式序列、优势位点及优势氨基酸、生物进化中关键氨基酸的同源保守特性，使用天然氨基酸进行抗菌肽的虚拟组合设计，并通过计算机程序筛选和预测设计的抗菌肽的可能抗菌效果，最后通过实验方法检验抗菌肽理论设计与高效筛选的可靠性与准确性，为抗菌肽设计与筛选的理论研究奠定坚实基础。本专利技术的基于人体自身分泌的新型抗菌活性肽AMP以人源性蛋白为模版，有很好的生物兼容性，可有效的避免异种蛋白对机体的免疫损伤。每种AMP的长度仅为原SPLUNC1蛋白的十分之一，并且合成简单、成本低廉。新合成的AMP来源于人体高度保守的氨基酸序列，具有高度的生物稳定性和适当的半衰期，具有广阔的潜在应用前景。经体外实验证实新合成的AMP具有较好的水溶性、广谱的抗细菌、抗真菌作用，本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于人体自身分泌的新型抗菌活性肽，其特征在于，所述抗菌活性肽的氨基酸序列如下：AMP1：NLPLLDILKPGGGTSGGLLGGLLGKVTSVIPG；AMP2：AVRDKQHRIHLVLGDCTHSPGSLQISL；AMP3：PIQGLLDSLTGILNKVLPHLVQGNVCPLVNHVLRGL。

【技术特征摘要】
1.基于人体自身分泌的新型抗菌活性肽，其特征在于，所述抗菌活性肽的氨基酸序列如下：AMP1：NLPLLDILKPGGGTSGGLLGGLLGKVTSVIPG；AMP2：AVRDKQHRIHLVLGDCTHSPGSLQISL；AMP3：PIQGLLDSLTGILNKVLPHLVQGNVCPLVNHVLRGL。2.根据权利要求1所述新型抗菌活性肽，其特征在于，所述活性肽AMP1、AMP2、AMP3的核心区域分别位于SPLUNC1蛋白的70-101、165-191、199-234AA序列段。3.权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：卜艳红，莫喜明，周后德，
申请(专利权)人：中南大学湘雅二医院，
类型：发明
国别省市：湖南;43