一种马面鱼皮胶原蛋白抗氧化肽及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种马面鱼皮胶原蛋白抗氧化肽，其特征在于该抗氧化肽的氨基酸序列为Asn-Glu-Gly-Ala-Cys-Gly，UPLC-MS检测给出分子离子峰为[M]+531m/z。本发明专利技术还涉及上述马面鱼皮胶原蛋白抗氧化肽的制备方法，该方法采用双酶分步水解技术与超滤、凝胶柱层析技术联用，整个制备过程简单易控，酶解效率高，且所得抗氧化肽安全无副作用、具有较高的抗氧化活性，不仅对DPPH·自由基具有良好的清除效果，也具有较好的热稳定性，且该抗氧化肽经胃肠消化道消化后仍保持有较高的抗氧化活性；另外，本发明专利技术制备抗氧化肽所采用的原料为海洋低值鱼类马面鱼的加工废弃物，有效避免了环境污染、提高了资源的利用率。

【技术实现步骤摘要】
一种马面鱼皮胶原蛋白抗氧化肽及其制备方法
本专利技术涉及一种马面鱼皮胶原蛋白抗氧化肽，本专利技术还涉及该马面鱼皮胶原蛋白抗氧化肽的制备方法。
技术介绍
氧化作用是人类老化现象的重要原因之一，这一观点已经得到证实。研究表明，癌症、衰老或其它疾病等大都与过量的自由基具有关联，因此，如何抵抗人体内的氧化作用成为保健品、化妆品研发的主要方向之一，而寻求一种高效、低毒的抗氧化剂已成为近年来的研究热点。研究发现，蛋白质水解所得到的多肽具有良好的抗氧化活性，且分子量小、易吸收、安全可靠，因此抗氧化肽在食品加工、保健品、化妆品等诸多领域具有良好的应用前景。申请公布号为CN103524579A的中国专利技术专利申请《一种用鲨鱼醇溶蛋白制备的抗氧化肽及其制备方法和应用》披露了一种抗氧化肽，其是利用乙醇提取鲨鱼醇溶性蛋白并进一步利用酶工程技术、色谱技术制备的，该抗氧化肽安全无毒副作用，具有较高的抗氧化活性。然而，现有技术中的抗氧化肽一般热稳定性较差，且经过胃肠环境消化后抗氧化肽的活性易受到严重影响，从而降低其抗氧化性能。马面鱼又称剥皮鱼、橡皮鱼，是我国仅次于带鱼的海洋经济鱼类，而马面鱼的可食用部分较少，马面鱼的不可食用部分约占53％，其中鱼皮占8.5％～9.4％，马面鱼皮厚且硬，加工过程中鱼皮通常会被剥除丢弃，这样不仅污染环境，也造成了资源的浪费。其实，马面鱼皮中含有丰富的胶原蛋白，若对其进行开发利用制备活性肽，将会取得显著的经济效益和社会效益，但是，现有技术中，以马面鱼皮为原料制备胶原蛋白抗氧化肽的工艺鲜见报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，提供一种抗氧化活性高、热稳定性好且经胃肠环境消化后仍能保持较高活性的马面鱼皮胶原蛋白抗氧化肽。本专利技术所要解决的另一个技术问题是针对现有技术的现状，提供一种上述马面鱼皮胶原蛋白抗氧化肽的制备方法，该方法将双酶分步水解技术与超滤、凝胶柱层析技术联合使用，科学合理、易于操作。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种马面鱼皮胶原蛋白抗氧化肽，其特征在于该抗氧化肽的氨基酸序列为Asn-Glu-Gly-Ala-Cys-Gly，UPLC-MS检测给出分子离子峰为[M]+531m/z。一种上述马面鱼皮胶原蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)马面鱼皮的前处理将洗净、绞碎的马面鱼皮进行脱脂处理，脱脂处理完毕后过滤并对所得滤渣进行清洗；(2)马面鱼皮胶原蛋白的制备用乙酸将步骤(1)最后所得滤渣浸泡、离心后收集上清液，向该上清液中加入NaCl后离心处理，将所得沉淀用乙酸复溶并做透析处理，所得溶液即为马面鱼胶原蛋白，冷冻干燥后备用；(3)胶原蛋白的双酶分步水解将步骤(2)所得马面鱼胶原蛋白用缓冲液配置为溶液，然后依次用ProteaseAAmano2G、酸性蛋白酶进行水解，水解完毕后收集上清液备用；(4)抗氧化肽的分离对步骤(3)所得上清液进行超滤，收集分子量小于5kDa的抗氧化肽组分，再用SephadexG-15凝胶柱层析，收集在220nm下有吸收峰的组分，该组分经冷冻干燥后即得所述的马面鱼皮胶原蛋白抗氧化肽。作为优选，步骤(1)的具体过程为：将洗净、绞碎的马面鱼皮按固液重量比1:10～20加入体积浓度为5～15％的异丙醇中，浸泡脱脂10～20h后过滤除去异丙醇，用蒸馏水清洗滤渣后再将该滤渣按固液重量比1:5～10加入质量浓度为7～10％的NaCl溶液中，浸泡12～24h后过滤，所得滤渣用蒸馏水清洗后备用。作为改进，步骤(2)的具体过程为：将步骤(1)最后所得滤渣按固液重量比1:10～30加入浓度为0.1～0.5mol/L的乙酸中浸泡12～36h，然后在8000～10000r/min的条件下离心处理收集上清液；向所得上清液中加入NaCl至NaCl质量浓度为6～9％，然后在8000～10000r/min的条件下离心处理，所得沉淀用0.4～0.6mol/L的乙酸溶液复溶后，透析24～30h，所得溶液即为马面鱼胶原蛋白，冷冻干燥后备用。再改进，步骤(3)的具体过程为：用pH为6.5～7.5的磷酸缓冲液将上述马面鱼皮胶原蛋白配成质量浓度为2～6％的溶液，然后加入ProteaseAAmano2G酶解1～4h，得到水解液A；将水解液A用稀盐酸调节pH值至2.2，加入酸性蛋白酶继续水解2～5h，得到水解液B，将水解液B煮沸并保温8～15min，冷却后在8000～10000r/min的条件下离心处理并收集上清液备用。优选地，步骤(4)中收集220nm下有吸收峰的组分时，以pH为7.2的磷酸盐缓冲液为洗脱液，在0.2～0.3mL/min的流速下进行分离。在上述方案中，所述ProteaseAAmano2G及酸性蛋白酶的酶用量均≥3600U/g。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：(1)本专利技术的抗氧化肽具有较高的抗氧化活性，不仅对DPPH·自由基具有良好的清除效果，也具有较好的热稳定性，该抗氧化肽在20、40、60、80、100℃下分别保温2h后，抗氧化活性均保持在90％以上；该抗氧化肽经胃消化道消化后其抗氧化活性保持率为89.99％，经胃肠消化道消化后其抗氧化活性保持率为80.53％，仍保持了较高的抗氧化活性，因此，本专利技术的抗氧化肽作为功能因子添加到健康食品、化妆品中具有较好应用前景；(2)本专利技术采用双酶分步水解技术与超滤、凝胶柱层析技术联用，整个制备过程简单易控、酶解效率高，且所得抗氧化肽安全无副作用；(3)本专利技术所采用的原料为海洋低值鱼类马面鱼的加工废弃物，有效避免了环境污染、提高了资源利用率。附图说明图1为本专利技术中Asn-Glu-Gly-Ala-Cys-Gly的UPLC-MS图谱；图2为本专利技术中Asn-Glu-Gly-Ala-Cys-Gly对DPPH·自由基的清除作用图；图3为温度对本专利技术中Asn-Glu-Gly-Ala-Cys-Gly的活性影响图；图4为胃肠消化酶对本专利技术中Asn-Glu-Gly-Ala-Cys-Gly的活性影响图。具体实施方式以下结合附图实施例对本专利技术作进一步详细描述。实施例1：本实施例中马面鱼皮胶原蛋白抗氧化肽的制备方法包括以下步骤：(1)马面鱼皮的前处理将洗净、绞碎的马面鱼皮按固液重量比1:20加入体积浓度为5％的异丙醇中，浸泡脱脂10h后过滤除去异丙醇，用蒸馏水清洗滤渣后再将该滤渣按固液重量比1:5加入质量浓度为10％的NaCl溶液中，浸泡12h后过滤，所得滤渣用蒸馏水清洗后备用；(2)马面鱼皮胶原蛋白的制备将步骤(1)最后所得滤渣按固液重量比1:10加入浓度为0.5mol/L的乙酸中浸泡12h，然后在10000r/min的条件下离心处理收集上清液；向所得上清液中加入NaCl至NaCl质量浓度为6％，然后在8000r/min的条件下离心处理，所得沉淀用0.6mol/L的乙酸溶液复溶后，透析24h，所得溶液即为马面鱼胶原蛋白，冷冻干燥后备用；(3)胶原蛋白的双酶分步水解用pH为6.5的磷酸缓冲液将上述马面鱼皮胶原蛋白配成质量浓度为6％的溶液，然后加入ProteaseAAmano2G酶解4h，得到水解液A；将水解液A用2mol/L的稀盐酸调节pH值至2.2，加入酸性蛋白酶继续水解5h，得到水解液B，将水解液B煮沸并保温8min，冷却后在10000r/本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种马面鱼皮胶原蛋白抗氧化肽，其特征在于该抗氧化肽的氨基酸序列为Asn‑Glu‑Gly‑Ala‑Cys‑Gly，UPLC‑MS检测给出分子离子峰为[M]+531m/z。

【技术特征摘要】
1.一种马面鱼皮胶原蛋白抗氧化肽，其特征在于该抗氧化肽的氨基酸序列为Asn-Glu-Gly-Ala-Cys-Gly，UPLC-MS检测给出分子离子峰为[M]+531m/z。2.一种权利要求1所述马面鱼皮胶原蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)马面鱼皮的前处理将洗净、绞碎的马面鱼皮进行脱脂处理，脱脂处理完毕后过滤并对所得滤渣进行清洗；(2)马面鱼皮胶原蛋白的制备用乙酸将步骤(1)最后所得滤渣浸泡、离心后收集上清液，向该上清液中加入NaCl后离心处理，将所得沉淀用乙酸复溶并做透析处理，所得溶液即为马面鱼胶原蛋白，冷冻干燥后备用；(3)胶原蛋白的双酶分步水解将步骤(2)所得马面鱼胶原蛋白用缓冲液配置为溶液，然后依次用ProteaseAAmano2G、酸性蛋白酶进行水解，水解完毕后收集上清液备用；(4)抗氧化肽的分离对步骤(3)所得上清液进行超滤，收集分子量小于5kDa的抗氧化肽组分，再用SephadexG-15凝胶柱层析，收集在220nm下有吸收峰的组分，该组分经冷冻干燥后即得所述的马面鱼皮胶原蛋白抗氧化肽。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(1)的具体过程为：将洗净、绞碎的马面鱼皮按固液重量比1:10～20加入体积浓度为5～15％的异丙醇中，浸泡脱脂10～20h后过滤除去异丙醇，用蒸馏水清洗滤渣后再将该滤渣按固液重量比1:5～10加入质量浓度为7～10％的NaCl溶液中，浸泡1...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹少谦，戚向阳，柳余莉，杨华，
申请(专利权)人：浙江万里学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33