本发明专利技术属于微生物发酵，特别是指一种枯草工程菌Bacillus subtilis及其构建以及利用其生产脱毛酶制剂的方法。是利用基因工程技术构建皮革脱毛用枯草工程菌Bacillus subtilis CGMCC No.11625，将其接种于含有碳源、氮源、必要的营养元素及抗生素的无菌发酵培养基中经通气发酵制成发酵液，发酵液经后处理制成脱毛酶制剂。本发明专利技术有效解决了现有技术存在的现有脱毛酶制剂中胶原蛋白酶水解生皮中胶原蛋白而造成的烂皮、粒面破损的技术难题。具有各原料组分来源容易、制备方法及后处理工艺简单、所制备的酶制剂安全环保、对生皮质量损害较小等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物发酵，特别是指一种枯草工程菌Bacillussubtilis及其构建 以及利用其生产脱毛酶制剂的方法。
技术介绍
皮革作为畜牧业的副产品，越来越多的引起人们重视。随着科学技术的进步，皮革 制品档次日新月异，成品革面料向着薄、软、有力度方向发展。市场需要促进制革业发展，同 时也要求制革业发展建立在节能减排、低碳环保的基础上，目前制革多采用灰碱法脱毛，灰 碱法以硫化钠为主，将毛溶解，废水自然排出。一个转鼓每月要排除5吨盐碱废水，碱浓度高 达25%以上，仅河北省蠡县一个制革区每月要排污水2000吨，全国要排1300万吨废水，一年 排放约1.5亿吨废水，且未采取污水处理手段。经有关管理部门对制革区深井水测定，100米 以上均被污染，污染物超过饮用水标准，对环境造成的污染严重危害了人体健康。中性蛋白 酶能够消解生皮毛囊周围与表皮、真皮连结的蛋白，削弱毛与表皮、真皮的紧密依附，达到 脱毛的目的。中性蛋白酶脱毛制剂项目的研发被业内专家普遍认为是节能、减排、治污制革 理想的新技术，而且微生物酶制剂易得，资源丰富，制备过程没有污染，用于制革业完全符 合国家节能减排的发展战略。推广使用后可节约水资源并减少污水排放量50%以上，有效 的缓解制革业对环境的污染。 中性蛋白酶脱毛制剂具有广阔的前景，但由于野生菌株AS1.398发酵产蛋白酶系 中胶原蛋白酶的存在，能水解生皮中胶原蛋白，不可避免损伤真皮的结构，影响皮制品的性 能；而分离蛋白酶系中胶原蛋白酶工艺复杂，增加了酶制剂成本;且分离纯化工艺精细，不 宜工厂化操作进而限制了酶制剂的推广应用。【专利
技术实现思路
】 本专利技术的目的在于提供一种不含胶原蛋白酶基因但可以表达中性蛋白酶的枯草 工程菌BacillussubtilisCGMCCNo. 11625。本专利技术的目的之二是提供一种上述工程菌的构建方法。 本专利技术的目的之三是提供一种利用枯草工程菌BacillussubtilisCGMCC No. 11625生产脱毛酶制剂的方法。本专利技术的整体技术构思是： -种枯草工程菌BacillussubtilisCGMCCNo. 11625。 本专利技术中的菌种申请人已于2015年11月6日提交位于北京市朝阳区北辰西路1号 院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，该保藏单位的简称为 CGMCC，保藏编号为:CGMCCNo. 11625。 枯草工程菌的构建方法，该方法包括如下工艺步骤：A、中性蛋白酶基因npr的扩增根据NCBI中供体菌--解淀粉芽抱杆菌BacillusamyloliquefaciensCGMCC No. 1 . 3 9 8的中性蛋白酶基因npr序列设计引物如下，上游引物为：5'-CCGATTACAAAAACATCAGCCGTAGGATCCCATCAGCTTAAAGAGAATCAAAC-3'，其中下划线部分为BamH I酶切位点，5 3bp;下游引物为：5 ' - CCCGCTCATTAGGCGGGCTGCCCCGGGTTACAATCCAACAGCATTCCAGGCTG-3'，其中下划线部分为Sma頂每切位点，53bp;进行PCR扩增，PCR扩增产物利用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析；B、重组载体的构建将PCR扩增产物回收后，与用BamHI和SmaI双酶切的载体pHT43经Gibson连接后 转化至大肠埃希氏菌EscherichiacoliBL21Rosetta感受态中，通过10-100μg/mlAmp抗 性筛选重组质粒，将测序正确的重组质粒命名为pHT43-npr;C、将上述构建好的重组表达质粒pHT43-npr通过Spizizen盐法转化到受体菌-- 枯草芽孢杆菌BacillussubtilisTO800N中，在10-100μg/ml氯霉素抗性的LB平板上筛选 转化子，挑取阳性转化子接种在脱脂牛奶平板上，菌落周围产生水解圈的为目标转化子，得 到枯草工程菌BacillussubtilisCGMCCNo. 11625;其中npr基因供体菌选用解淀粉芽抱杆菌BacillusamyloliquefaciensCGMCC No. 1.398,购自中国科学院微生物研究所;大肠埃希氏菌EscherichiacoliBL21Rosetta 购自普如汀生物技术（北京）有限公司；受体菌为枯草芽孢杆菌表达宿主Bacillus subti1isWB800N及质粒pHT43，购自MoBiTec公司。利用枯草工程菌BacillussubtilisCGMCCNo. 11625制备脱毛酶制剂的方法，是 将所述的菌种接种于含有碳源、氮源、必要的营养元素及抗生素的无菌发酵培养基中经通 气发酵制成发酵液，发酵液经后处理制成脱毛酶制剂。 本专利技术的具体技术构思还有： 所述的发酵培养基采用如下单位质量百分含量的原料组成:麦麸2%-6%;玉米粉 2%-5%;蛋白胨l%-2%;NaH2P〇4 0·2%-〇·4%;Κ2ΗΡ〇4 0·02%-0·04%;豆油0.01%_ 0 · 05% ;余量为水;发酵培养基消前ρΗ=5 · 5-6 · 6，消后ρΗ=6-7。 通气发酵条件如下：按照质量百分比为1 %的接种量接种，压力0.03-0.05MPa，搅 拌转速为150-250转/分钟，在发酵液中0D6Q() = 0.5时添加终浓度为0.5-2.5mmol的IPTG作为 诱导剂，当发酵液中酶活下降为发酵终点； 通风量的条件如下： 0-12小时内：通风量l:0.5-0.7vvm;12-24小时：通风量1:0·8-1·Ovvm; 24-40小时：通风量1:0 · 9-1 · 2vvm; 40小时至发酵结束:通风量1:0 · 8-1 ·Ovvm;温度条件如下： 0-8小时:温度为32°C-35°C; 8-14小时：温度为35°C-37°C; 14小时至发酵结束:温度为37°C。 为降低生产成本，优选且较为常见的技术方案是，所述的通气发酵前包括扩大培 养。 所述的扩大培养包括如下步骤： A、将菌种制成摇瓶种子；B、将摇瓶种子制成一级种子； 所述的菌种培养基由如下质量百分含量的原料组成： 蛋白胨 牛肉膏l%-5%;Nacll%-5%;余量为水;ρΗ=6·8-7·5; 菌种的培养条件为:温度30°C_37°C，培养12-24h。 所述的步骤A是将0D6Q() = 5的LB培养基菌液与质量百分比为20%-50%的甘油混合 后制成液体菌种，将液体菌种接种至无菌的摇瓶种子培养基培养后制成摇瓶种子； 所述的摇瓶种子培养基由如下质量百分含量的原料组成： 蛋白胨1 % -5 % ;牛肉膏1 % -5 % ;Nac11 % -5 % ;余量为水;抗生素选用浓度为10- 100μg/ml的氯霉素;pH=6 · 8-7 · 5; 培养条件如下:摇瓶装量体积比为10%-25%，温度33°C_37°C，转速为180-220转/ 分钟，培养周期12小时-18小时。所述的步骤B是将摇瓶种子接种至无菌种子培养基经通气发酵制成种子液；所述的种子培养基由如下质量百分含量的原料组成： 蛋白胨1 % -5 % ;牛肉膏1 % -5 % ;Nac11 % -5 % ;余量为水;抗生素选用浓度为10- 100μg/ml的氯霉素;pH=6 · 8-本文档来自技高网...
【技术保护点】
枯草工程菌Bacillus subtilis，其特征在于其保藏编号为CGMCC No.11625。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑翔，胡美荣，刘春卯，陶勇，薛刚，马清河，秦艳梅，胡常英，杨何宝，李江燕，董聪，
申请(专利权)人：河北省微生物研究所，中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：河北;13
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。