公开了生产O-乙酰基高丝氨酸的埃希氏菌属微生物，和利用该微生物高产率生产O-乙酰基高丝氨酸的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及生产0-乙酰基高丝氨酸的埃希氏菌属（Escherichia sp.)微生物，和 用该微生物高产率生产〇-乙酰基高丝氨酸的方法。
技术介绍
0-乙酰基高丝氨酸是甲硫氨酸的前体，而甲硫氨酸是身体必需氨基酸之一。甲硫 氨酸作为医用输注液的组分和医疗产品原料以及动物饲料和食物添加剂已被广泛使用。 甲硫氨酸可生物学或化学合成。近来，公开了两步法，其中将通过发酵生产的 L-甲硫氨酸前体通过酶反应转化成L-甲硫氨酸（国际公开号WO 2008/013432)。在上述 两步法中，〇-琥珀酰基高丝氨酸和〇-乙酰基高丝氨酸可用作甲硫氨酸前体，并且高产率生 产0-乙酰基高丝氨酸以大规模成本有效地生产甲硫氨酸非常重要。
技术实现思路
技术问题 专利技术人在试图提高0-乙酰基高丝氨酸生产时发现柠檬酸合酶蛋白的表达或活性 减少可显著增加0-乙酰基高丝氨酸的生产能力，从而完成本专利技术。 技术方案 本专利技术的一个目的是提供0-乙酰基高丝氨酸生产能力提高的0-乙酰基高丝氨酸 生产微生物。 本专利技术的另一目的是提供利用该微生物生产0-乙酰基高丝氨酸的方法。 有利效果 使用根据本专利技术所述的具有0-乙酰基高丝氨酸生产能力的微生物可比化学合成 以更高产率和更加环境友好的方式生产〇-乙酰基高丝氨酸。另外，由此生产的〇-乙酰基 高丝氨酸可通过0-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶，用作甲硫氨酸和乙酸合成的前体，从而实 现L-甲硫氨酸的生物转化，并且由此转化的L-甲硫氨酸可广泛用于生产人类食物或食物 添加剂以及动物饲料或动物饲料添加剂。 附图简述 图1是用于构建柠檬酸合酶活性减弱的微生物的表达盒设计。 图2是pBAD24-柠檬酸合酶反义RNA(asRNA)载体的限制图谱。 最佳方式 -方面，本专利技术提供生产0-乙酰基高丝氨酸的埃希氏菌属微生物，其中内源柠檬 酸合酶蛋白的活性被减弱或灭活。 如本文所用，术语"0-乙酰基高丝氨酸" 一一其是微生物的甲硫氨酸生物合成途 径中的具体中间材料--意指L-高丝氨酸的乙酰基衍生物。0-乙酰基高丝氨酸可利用高 丝氨酸和乙酰辅酶A作为底物、通过使乙酰基从乙酰辅酶A转移至高丝氨酸的酶活性来生 产。 如本文所用，术语"生产0-乙酰基高丝氨酸的微生物"包括这样的微生物：在活体 生物内生产〇-乙酰基高丝氨酸的真核或原核微生物，具有〇-乙酰基高丝氨酸生产能力，而 其亲本微生物不具有0-乙酰基高丝氨酸生产能力；或这样的微生物：内源地具有0-乙酰 基尚丝氣酸生广能力。 可通过物种的改良来提供或促进O-乙酰基高丝氨酸生产能力。具有O-乙酰基 高丝氨酸生产能力的微生物可包括属于埃希氏菌属、欧文氏菌属（Erwinia sp.)、沙雷氏菌 属（Serratia sp.)、普罗威登斯菌属（Providencia sp.)、棒状杆菌属（Corynebacteria sp.)、假单胞菌属（Pseudomonas sp.)、钩端螺旋体属（Leptospira sp.)、沙门氏菌 属（Salmonella sp.)、短杆菌属(Brevibacteria sp. )、Hypomononas sp.、色杆菌属 (Chromobacterium sp·)、和诺卡氏菌属（Norcardia sp·)、或真菌、或酵母的微生物；具体 地，属于埃希氏菌属、棒状杆菌属、钩端螺旋体属、和酵母的微生物；和更具体地，属于埃希 氏菌属的微生物，具体例如，大肠杆菌（Escherichia Coli)。具有0-乙酰基高丝氨酸生产 能力的微生物可以是生产下列的微生物：L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、或L-甲硫氨 酸或其衍生物，但不限于此。 如本文所用，术语"柠檬酸合酶（E. C. 2. 3. 3. 1) "意指介导草酰乙酸盐 (oxaloacetate)和乙酰辅酶A之间的反应的TCA循环第一步中的酶。具体地，梓檬酸合酶 介导乙酰辅酶A中具有两个碳原子的乙酸残基和具有四个碳原子的草酰乙酸盐之间的缩 合反应，从而生成具有六个碳原子的柠檬酸盐（citrate)。在大肠杆菌中，柠檬酸合酶被命 名为GltA，柠檬酸合酶和GltA在本专利技术中可互换使用。 乙酰辅酶A+草酰乙酸盐+H2O -柠檬酸盐+辅酶A-SH 具体地，柠檬酸合酶可以是源自埃希氏菌属的柠檬酸合酶，更具体地源自大肠杆 菌的GltA。柠檬酸合酶可以是这样的蛋白质：包括SEQ ID NO :4表示的氨基酸序列；或与 SEQ ID NO :4的氨基酸序列具有70%或更高，具体地80%或更高、或更具体地90%或更高 的同源性的氨基酸序列。另外，作为具有同源性的序列，如果该氨基酸序列是具有与SEQ ID NO :4相同或相应柠檬酸合酶活性的氨基酸序列，则在部分序列中具有敲除、修饰、替换、或 添加的氨基酸序列显然也应被包括在本专利技术的范围内。另外，基于遗传密码简并，编码相同 氨基酸序列和其变体的多核苷酸序列也应被包括本专利技术的范围内。 如本文所用，术语"内源"活性意指蛋白质在微生物中的天然状态或微生物中提供 的相应蛋白质在修饰前的活性状态。 "蛋白质活性与其内源活性相比减弱或灭活（失活，inactivation) "意指蛋白质 活性在与其天然状态具有的活性相比时降低或消除。减弱是表示如下情况的概念：由于蛋 白质编码基因的修饰，蛋白质活性与微生物原本具有的蛋白质活性相比降低；整体蛋白质 表达水平低于微生物自然型菌株的整体蛋白质表达水平；或其组合，但不限于此。灭活包括 如下情况：编码蛋白质的基因与自然型菌株相比完全不被表达；和基因被表达，但不呈现 活性。 蛋白质活性的减弱或灭活可通过本领域公知的各种方法实现。方法实例可包括用 修饰基因替换染色体上编码蛋白质的基因从而可降低酶活性（其包括去除蛋白质活性的 情况）的方法；在染色体上编码蛋白质的基因的表达调控序列上引入修饰的方法；用具有 弱活性或不具有活性的序列替换编码蛋白质的基因的表达调控序列的方法；敲除染色体上 编码蛋白质的基因的部分或整体的方法；引入反义寡核苷酸（例如，反义RNA)的方法，该 反义寡核苷酸通过互补结合至染色体上的基因的转录物而抑制从mRNA至蛋白质的翻译； 致使核糖体附着不能进行的方法一一通过在编码蛋白质的基因的SD序列前端人为添加 Shine-Dalgarno (SD)序列和其互补序列而形成二级结构；逆转录工程（RTE)方法--添加 启动子以在相应序列的开放阅读框（ORF)的3'端逆转录；等，并且也包括其组合，但不限于 此。 具体地，敲除编码蛋白质的基因的部分或整体的方法可通过如下进行：经由将染 色体插入微生物的载体，用多核苷酸或（在多核苷酸序列部分被敲除时）标记物替换染色 体中编码内源目标蛋白质的多核苷酸。例如，可采用通过同源重组进行基因敲除的方法，但 不限于此。另外，如本文所用，术语"部分"，虽然可依据多核苷酸种类而变，但可具体意指1 个核苷酸至300个核苷酸，更具体地1个核苷酸至100个核苷酸，还更具体地1个核苷酸至 50个核苷酸，但不限于此。 另外，修饰表达调控序列的方法可通过如下进行：诱导多核苷酸序列的表达调控 序列改变一一通过敲除、插入、保守型替换、非保守型替换或其组合，以进一步减弱表达调 控序列的活性；或用活性较弱的多核苷酸序列替换多核苷酸序列本文档来自技高网...
【技术保护点】
生产O‑乙酰基高丝氨酸的埃希氏菌属微生物，其中柠檬酸合酶的内源活性被减弱或灭活。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：金贤雅，徐主熙，申容旭，金素影，金相谦，罗光镐，裵智妍，孙晟光，柳慧连，崔珍根，
申请(专利权)人：CJ第一制糖株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国;KR
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