一种长牡蛎补体样分子CgC1qDC-1重组蛋白及其制备和应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体涉及一种长牡蛎补体样分子CgC1qDC-1重组蛋白及其制备和应用。CgC1qDC-1基因重组蛋白为序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列所示。本发明专利技术中的长牡蛎补体样分子CgC1qDC-1为包含C1q球状结构域的补体样分子C1qDC蛋白，其重组蛋白对革兰氏阴性菌的病原相关分子模式脂多糖具有较高的结合活性；同时，该蛋白能够增强长牡蛎血淋巴细胞对革兰氏阴性菌的吞噬能力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种长牡蛎补体样分子CgC1qDC-1重组蛋白及其制备和应用。
技术介绍
固有免疫系统(innate immunity)是免疫系统的重要组成部分，是宿主抵御病原入侵的第一道防线。无脊椎动物缺乏适应性免疫系统(adaptive immunity)，因此仅能依靠固有免疫抵御病原入侵。固有免疫主要通过抗菌肽/蛋白和吞噬作用杀伤并清除病原物，因此，对病原物的识别是诱发免疫反应的关键步骤。病原入侵宿主过程中，伴随其感染和复制，会产生一系列保守组分，称为病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)，这些PAMPs能够被宿主免疫细胞表面的模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)有效识别，进而诱导一系列的免疫级联反应。目前，无脊椎动物中已发现了十余类识别受体，如肽聚糖识别蛋白(PGRP)和Toll样受体等，它们通过结合不同的病原相关分子模式完成对各种病原微生物的识别，在诱导细胞因子和炎症的产生、抗菌肽的表达、激活酚氧化酶级联反应和吞噬作用等一系列固有免疫应答中发挥重要作用。因此，对模式识别受体的鉴定和功能研究一直是免疫学研究的热点。补体系统是固有免疫的重要组成部分，具有调理吞噬、介导炎症、溶解细胞和调节免疫应答等生物学功能。补体分子C1q(Complement 1q)是r>补体系统经典途径的重要识别分子，能够启动经典途径，并且在固有免疫和适应性免疫之间发挥重要的桥梁作用。现已在无脊椎动物中发现众多包含C1q球状结构域的补体样分子C1qDC蛋白(C1q domain-containing protein)，该类蛋白在无脊椎动物免疫防御和病原清除等方面发挥关键作用。因此，对补体样分子的发掘和利用有助于我们明确牡蛎免疫系统识别病原物的机制，揭示牡蛎免疫系统诱发和清除病原物的规律，最终为牡蛎病害防治、药物研发和良种选育提供理论基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种长牡蛎补体样分子CgC1qDC-1重组蛋白及其制备和应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种长牡蛎补体样分子CgC1qDC-1重组蛋白，CgC1qDC-1基因重组蛋白为序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列所示。一种长牡蛎补体样分子CgC1qDC-1重组蛋白的制备，(1)以长牡蛎补体样分子CgC1qDC-1编码区为模板，采用P1和P2引物进行PCR扩增，待用；(2)PCR扩增产物与将pEASY-E1载体通过T4连接酶连接，转化，测序鉴定重组子；(3)将上述构建载体转入Transetta(DE3)表达菌株中进行诱导培养，而后纯化、复性，即得到具有序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列的重组蛋白CgC1qDC-1；所述引物P1和P2分别为P1：5’-ATGTCCCAAAATGTTTTGATC-3’；P2：5’-GGCCAGTTTGAATCCAGAG-3’。一种长牡蛎补体样分子CgC1qDC-1重组蛋白的应用，所述序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列的CgC1qDC-1重组蛋白用于制备病原菌识别或促吞噬活性的制剂。本专利技术所具有优点：本专利技术中的长牡蛎补体样分子CgC1qDC-1为包含C1q球状结构域的补体样分子C1qDC蛋白，其重组蛋白对革兰氏阴性菌的病原相关分子模式脂多糖具有较高的结合活性；同时，该蛋白能够增强长牡蛎血淋巴细胞对革兰氏阴性菌的吞噬能力。本专利技术的对长牡蛎补体样分子CgC1qDC蛋白的研究，有利于深入揭示长牡蛎固有免疫作用机制，充分挖掘和利用海洋来源基因资源，在开发抗菌类药物和新型免疫增强剂、饲料添加剂等方面具有潜在应用价值，同时为海洋经济养殖动物的病害防治提供重要物质基础和理论支持。附图说明图1为本专利技术实施例提供的长牡蛎补体样分子CgC1qDC-1基因重组蛋白对革兰氏阴性菌病原相关分子模式脂多糖具有较强结合活性图。其中，如图A所示，拉下实验(pull down)表明，CgC1qDC-1对LPS具有较高的结合特异性；图B所示，酶联免疫吸附实验(ELISA)表明，CgC1qDC-1对LPS结合能力较强，解离常数Kd值为0.09×10-6M。图2为本专利技术实施例提供的长牡蛎补体样分子CgC1qDC-1基因重组蛋白增强血淋巴细胞对大肠杆菌和灿烂弧菌的吞噬作用图；其中，如图A所示，相比于对照组，CgC1qDC-1处理能够显著性上调血淋巴细胞对大肠杆菌(上图)和灿烂弧菌(下图)的吞噬比例；图B为CgC1qDC-1上调血淋巴细胞吞噬比例的统计学分析图。具体实施方式下面的实验例中将对本专利技术作进一步的阐述，但本专利技术不限于此。实施例1：长牡蛎补体样分子CgC1qDC-1基因编码区的体外原核重组表达，包括下列步骤：1、重组载体的构建本专利技术中采用的重组表达载体为北京全式金公司的pEASY-E1原核表达载体。通过PCR技术，使用基因特异性引物P1(5’-ATGTCCCAAAATGTTTTGATC-3’)和P2(5’-GGCCAGTTTGAATCCAGAG-3’)。扩增长牡蛎补体样分子CgC1qDC-1基因的编码区片段。反应条件为：首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行32个循环，最后72℃延伸10分钟。将PCR产物纯化回收，与pEASY-E1载体连接。转化后菌落PCR筛选并测序，提取阳性克隆质粒，完成载体的构建。2、重组蛋白的表达以Transetta(DE3)为重组表达菌株，将上述构建的重组载体转化到表达宿主菌中，挑取单克隆，提取质粒，测序验证读码框正确。挑取单克隆，接种于5mL LB液体培养基中，37℃震荡摇床中培养12-16小时，然后以1：100的比例接种200mL LB液体培养基中，37℃培养至OD600：0.5-0.7。加入IPTG，使终浓度达到0.5mM mL-1，继续培养5小时。4℃，6000rpm，离心10min，收集菌体，于-20℃冻存备用。取1mL菌液离心，弃去上清后，加入80μL水和20μL 5×蛋白上样缓冲液，100℃沸水煮沸10分钟，SDS-PAGE检测表达产物。3、重组蛋白的纯化将上述所得大肠杆菌总蛋白采用镍琼脂糖凝胶层析柱纯化获得重组蛋白，并透析除盐。具体操作步骤如下：镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化带本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种长牡蛎补体样分子CgC1qDC‑1重组蛋白，其特征在于：CgC1qDC‑1基因重组蛋白为序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列所示。

【技术特征摘要】
1.一种长牡蛎补体样分子CgC1qDC-1重组蛋白，其特征在于：
CgC1qDC-1基因重组蛋白为序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列所示。
2.一种根据权利要求1所述的长牡蛎补体样分子CgC1qDC-1重组蛋白的
制备，其特征在于：
(1)以长牡蛎补体样分子CgC1qDC-1编码区为模板，采用P1和P2引物
进行PCR扩增，待用；
(2)PCR扩增产物与将pEASY-E1载体通过T4连接酶连接，转化，测序
鉴定重组子；
(3)将上述构建载体转入Transetta(DE3...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋林生，姜帅，王玲玲，张峘，李慧，张道翔，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37