核心蛋白聚糖转基因小鼠的制备方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种核心蛋白聚糖转基因小鼠的制备方法及应用，涉及生物技术领域。本发明专利技术提供的核心蛋白聚糖转基因小鼠的制备方法，包括将Cas9分子、gRNA和含有Decorin基因的donor vector显微注射到小鼠受精卵中，获得F0代小鼠，然后将F0代小鼠与野生型小鼠交配获得能够表达Decorin基因的F1代小鼠。该制备方法简单方便，制备得到的转基因小鼠能够表达Decorin蛋白，该蛋白在全身皮肤脆性改变，关节滑膜炎，肌肉纤维化，血管病变等疾病以及生长发育过程中发挥重大作用，为以后疾病研究、发育研究以及肿瘤研究提供了小鼠模型，对各类疾病的在体研究奠定基础。病的在体研究奠定基础。病的在体研究奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
核心蛋白聚糖转基因小鼠的制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种核心蛋白聚糖转基因小鼠的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]遗传的基本物质是DNA，基因则是位于染色体上有遗传效应的DNA片段，对于储存在生物全套染色体中的全部遗传信息，可称其为基因组。由于不同种类、不同个体的生物基因组成是不同的，因此对动物个体来说，非自身的基因成分属于外源基因，如果把外源基因整合或导入动物染色体基因中，那么这个外源基因就被称为转基因(transgene)(即转移来的基因)，这种动物就是转基因动物(transgenic animals)。
[0003]CRISPR/Cas9系统是近年来兴起的一种新型基因编辑技术。它是一种原核生物免疫系统,被用来抵抗噬菌体病毒和外源质粒等外来遗传物质的入侵。它能够识别并切断外源DNA，正是由于如此精确的靶向功能,使得外源基因的表达被沉默。CRISPR/Cas9系统在基因编辑过程中主要依赖于sgRNA和靶序列DNA的互补配对。因此，只需要根据目标基因靶点识别的前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motif,PAM)设计一段20～24bp的引物序列sgRNA,识别并结合到基因序列上,Cas9核酸内切酶就会在靶序列位置切割基因序列,从而会引起自身修复系统对DNA进行修复,如同源重组修复机制(homology directed repair,HDR)或非同源末端连接修复机制(non
‑
homologous end joining,NHRJ),最终使基因组DNA缺失、插入或发生移码突变,从而对目的基因进行有效的敲除、敲入或修饰等,完成基因编辑。通过编辑小鼠受精卵细胞的基因,并引入代孕母鼠体内,从而实现基因编辑小鼠模型的构建。2013年初,已有实验组将CRISPR/Cas9技术成功地运用在小鼠和人细胞中并实现了精确的基因编码,随之而来的便是CRISPR/Cas9技术的迅速发展,其在基因编辑领域发挥着巨大的发展潜力。
[0004]目前对于decorin基因的小鼠尚未有人完成转基因鼠的制备，大量相关基因背景的疾病研究缺少该哺乳类动物模型的使用，完成疾病机制及治疗研究急需制备一种哺乳类动物模型。
[0005]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的第一目的在于提供一种核心蛋白聚糖转基因小鼠的制备方法，该方法简单方便，制备得到的转基因小鼠能够作为模型用于各类疾病的研究。
[0007]本专利技术的第二目的在于提供一种采用上述制备方法制备得到的转基因小鼠在疾病研究中的应用。
[0008]第一方面，本专利技术提供了一种核心蛋白聚糖转基因小鼠的制备方法，包括以下步骤：将Cas9分子、gRNA和donor vector显微注射到小鼠受精卵中，获得F0代小鼠，然后将F0代小鼠与野生型小鼠交配获得阳性F1代小鼠；
[0009]所述donor vector包括Decorin基因，用于将Decorin基因插入至小鼠基因组中。
[0010]作为进一步技术方案，所述Cas9分子包括Cas9蛋白或Cas9核酸分子。
[0011]作为进一步技术方案，所述gRNA的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0012]作为进一步技术方案，所述Decorin基因的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0013]作为进一步技术方案，所述donor vector中，Decorin基因的5
’
端连接有启动子；
[0014]优选地，所述启动子包括CAG启动子。
[0015]作为进一步技术方案，所述donor vector中，Decorin基因的3
’
端连接有报告基因；
[0016]优选地，所述报告基因包括TdTomato；
[0017]优选地，所述Decorin基因和报告基因通过2A肽连接；
[0018]优选地，所述2A肽包括P2A。
[0019]作为进一步技术方案，所述小鼠包括C57BL/6JGpt小鼠。
[0020]作为进一步技术方案，所述阳性F1代小鼠经过鉴定获得；
[0021]优选地，所述鉴定的方法包括测序鉴定或者PCR扩增鉴定。
[0022]作为进一步技术方案，所述PCR扩增鉴定的步骤包括：提取F1代小鼠DNA，采用引物组1、引物组2和引物组3进行扩增，根据扩增结果鉴定获得阳性F1代小鼠；
[0023]所述引物组1包括引物H11
‑
tF1和引物H11
‑
CAG
‑
5tR1，引物H11
‑
tF1的序列如SEQ ID NO.3所示，引物H11
‑
CAG
‑
5tR1的序列如SEQ ID NO.4所示；
[0024]所述引物组2包括引物Rabbit
‑
pA
‑
tF1和引物H11
‑
tR2，引物Rabbit
‑
pA
‑
tF1的序列如SEQ ID NO.5所示，引物H11
‑
tR2的序列如SEQ ID NO.6所示；
[0025]所述引物组3包括引物H11
‑
wt
‑
tF1a和引物H11
‑
wt
‑
tR1a，引物H11
‑
wt
‑
tF1a的序列如SEQ ID NO.7所示，引物H11
‑
wt
‑
tR1a的序列如SEQ ID NO.8所示。
[0026]第二方面，本专利技术提供了一种采用上述制备方法制备得到的转基因小鼠在疾病研究中的应用；
[0027]优选地，所述疾病包括关节滑膜炎、肌肉纤维化或血管病变中的至少一种。
[0028]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0029]本专利技术提供的核心蛋白聚糖转基因小鼠的制备方法，包括将Cas9分子、gRNA和含有Decorin基因的donor vector显微注射到小鼠受精卵中，获得F0代小鼠，然后将F0代小鼠与野生型小鼠交配获得能够表达Decorin基因的F1代小鼠。该制备方法简单方便，制备得到的转基因小鼠具有以下优势：
[0030](1)使用哺乳小鼠完成本蛋白的表达，保证了基因表达改变在体情况的真实反映。(2)该蛋白在全身皮肤脆性改变，关节滑膜炎，肌肉纤维化，血管病变例如动脉瘤，脑血管畸形，肝血管畸形，肺部血管畸形等疾病以及生长发育过程中发挥重大作用，为以后疾病研究、发育研究以及肿瘤研究提供了小鼠模型，对各类疾病的在体研究奠定基础。
附图说明
[0031]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核心蛋白聚糖转基因小鼠的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将Cas9分子、gRNA和donor vector显微注射到小鼠受精卵中，获得F0代小鼠，然后将F0代小鼠与野生型小鼠交配获得阳性F1代小鼠；所述donor vector包括Decorin基因，用于将Decorin基因插入至小鼠基因组中。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Cas9分子包括Cas9蛋白或Cas9核酸分子。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述gRNA的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Decorin基因的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述donor vector中，Decorin基因的5
’
端连接有启动子；优选地，所述启动子包括CAG启动子。6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述donor vector中，Decorin基因的3
’
端连接有报告基因；优选地，所述报告基因包括TdTomato；优选地，所述Decorin基因和报告基因通过2A肽连接；优选地，所述2A肽包括P2A。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述小鼠包括C57BL/6JGpt小鼠。8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述阳性F1代小鼠经过鉴定获得；优选地，所述鉴定的方法包括测序鉴定或者PCR扩增鉴定。9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述PCR扩增鉴定的步骤包括：提取F1代小鼠DNA，采用引...

【专利技术属性】
技术研发人员：文铮，吴俊，姜朋军，杨书哲，王凯文，杨俊华，刘洋，张家明，聂欣，郭帅炜，陈鑫，王硕，刘清源，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京天坛医院，
类型：发明
国别省市：