一种具有广谱抑菌性的新菌种及其抑菌物质的提纯制造技术

本发明专利技术公开了一种具有广谱抑菌性的新菌种及其抑菌物质的提纯，属于微生物技术领域。本发明专利技术提供的一种新菌种为链球菌属，其分类学上与streptococcus sanguinis亲缘关系最近，我们将其命名为cpnp，该菌株已于2022年7月保藏于广东菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC 62706。所述菌株cpnp通过体外抑菌试验证实该菌株对包括大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌等致病菌株具有良好的抑菌性。假单胞菌等致病菌株具有良好的抑菌性。假单胞菌等致病菌株具有良好的抑菌性。

【技术实现步骤摘要】
一种具有广谱抑菌性的新菌种及其抑菌物质的提纯


[0001]本专利技术属于微生物
，尤其涉及一种具有有广谱抑菌性的新菌种及其抑菌物质的提纯。

技术介绍

[0002]随着临床上抗生素制品的广泛使用，因其所带来的细菌耐药性增强、机体正常菌群失调等负面影响也逐渐显现，成为临床治疗感染的巨大挑战。作为后抗生素时代的曙光
‑
益生菌，已被证明对宿主存在诸多的益处，从平时饮用的酸奶制品到各种益生菌制剂，益生菌已经应用在关于人体健康的各个方面。诸多研究及临床研究不仅表明服用益生菌可以有效降低人体胆固醇、降低血压、抗肿瘤、促进营养物质的产生代谢利用和调节免疫而且在拮抗致病菌方面也表现出了广阔的应用前景。
[0003]甲型链球菌作为人体上呼吸道的正常菌群，可占健康人口咽部菌群的优势菌，同时在抵抗上呼吸道感染的非特异性免疫反应中发挥了重要作用。相关研究显示使用含有甲型链球菌株的益生菌制剂协同其它药物来治疗呼吸道感染性疾病相较于单纯使用抗生素有着更好的疗效。

技术实现思路

[0004]针对上述问题，本专利技术提供一种具有广谱抑菌性的甲型链球菌新菌种及其抑菌物质的提纯。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案。
[0006]本专利技术提供一种具有广谱抑菌性的菌种，其特征在于，所述菌株属于链球菌属mitis群与streptococcus sanguinis亲缘关系最近，命名为cpnp，已于2022年07月12日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62706。
[0007]本专利技术还提供一种菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分包括权利要求1所述的广谱抑菌性菌种cpnp或cpnp菌体胞外分泌物或培养菌株cpnp得到的菌液。
[0008]上述菌株或菌剂在制备抑制致病菌株的生物制剂中的应用。
[0009]进一步地，所述致病菌株包括大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和/或肺炎链球菌。
[0010]本专利技术还提供一种用于抑制致病菌株的抑菌剂，其特征在于，所述抑菌剂包含作为活性成分的权利要求1所述广谱抑菌性菌种cpnp菌体或权利要求2所述的菌剂。
[0011]进一步地，所述cpnp菌体与其培养上清液均可对致病菌株产生显著的拮抗作用。
[0012]进一步地，所述cpnp菌株在产生显著拮抗作用的最佳浓度为1x109CFU/mL。
[0013]进一步地，所述致病菌株包括大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和/或肺炎链球菌。
[0014]本专利技术还提供一种治疗致病菌株的药物，其特征在于，所述药物包括上述菌株或
caagctaatc tctgaaagcc agtctcagtt cggattgtag gctgcaactc gcctacatga agtcggaatc gctagtaatc gcggatcagc acgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc acgagagttt gtaacacccg aagtcggtga ggtaaccgta aggagccagc cggctttagg ggttggcga。
[0024]实施例1 cpnp菌株的分离和纯化。
[0025]菌株分离于中国沈阳地区健康青年口咽部。具体步骤如下：对中国沈阳地区健康青年志愿者进行咽拭子采集，并置于冰盒中运输至实验室，将咽拭子置于1mL的灭菌生理盐水中，使用涡旋混匀仪充分震荡混匀30秒，取100μL混悬液涂布到含有5%脱纤维羊血的营养琼脂培养基，37℃下培养24小时，选择平板上呈圆形隆起，白色，针尖大小有α溶血现象的细小菌落，通过多次划线培养纯化细菌。通过牛津杯法对纯化细菌抗菌活性进行选择，方法如下：取分离纯化的菌株和致病菌株（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌）溶入BHI液体培养基中于37℃摇床培养箱中过夜培养。使用无菌生理盐水将致病菌浓度调至106CFU/mL，取100
µ
L涂布于营养琼脂培养基，使用无菌镊子将3个无菌牛津杯均匀放置在培养基上，使用无菌生理盐水将分离纯化菌株调至109CFU/mL，吸取200
µ
L加入牛津杯中，对照组加入200
µ
L生理盐水，置于37℃细菌培养箱，培养24h，观察治病菌株平板上是否产生透明抑菌环，最终得到一株具有广谱抗性菌株cpnp，见图1。
[0026]实施例2 cpnp菌株分子鉴定。
[0027]提取cpnp基因组DNA。使用细菌16S rRNA通用引物对16S rRNA进行扩增，并将扩增产物进行测序。对测序结果使用BLAST进行比对，发现cpnp与Streptococcus sanguinis同源性最高，Per. Ident值分别为99.86%。在GenBank数据库中下载细菌所在链球菌属中所有已知种的16S rRNA基因序列，使用MEGA 7软件，以肠球菌属EnterococcusfaealisATCC 19433T作为外群对链球菌属构建Neighbor
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Joining系统进化发生树，见图2，系统进化树的结果也支持了BLAST的结论。根据上述两个结果可以确认，拮抗菌cpnp属于streptococcus mitis group中的一员。进一步将cpnp基因组DNA进行框架图测序，并将测序结果使用基因组在线杂交软件（http://ggdc.dsmz. de/）与streptococcus mitis group的链球菌种进行dDDH杂交，该方法被认为是确定菌株种属关系的金标准，当基因组相似性>70%时认为是同一种。结果见表1，结果显示cpnp与streptococcus mitis群中已知种的基因组相似性均<70%，综合上述结果，我们认为cpnp为链球菌属内的新种。
[0028]表1 cpnp菌株分子鉴定
。
[0029]实施例3菌株安全性评价。
[0030]使用生理盐水将离心清洗后的cpnp菌体稀释为1x109CFU/mL、1x108CFU/mL、1x107CFU/mL的高、中、低浓度，通过雾化吸入的方式给予SPF级昆明种小鼠7天（表2）和28天（表3），对实验动物的体重、采食量、脏器系数、血常规、生化指标和炎性因子指标进行分析，结果证明cpnp为安全性的菌株。
[0031]表2菌株安全性评价（7天）
。
[0032]表3菌株安全性评价（28天）。
[0033]实施例4抑菌物质粗提。
[0034]将5%脱纤维羊血营养琼脂平板培养的cpnp接种至BHI液体培养基于37℃，摇床160r/min过夜培养，调cpnp菌悬液浓度至OD600=0.3，继续培养至8h。取培养液20mL，4200r/min下离心10min，将上清液经0.22um无菌滤膜过滤，将100μL的cpnp上清液与50μL浓度为106CFU/mL的金本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有广谱抑菌性的菌种，其特征在于，所述菌株属于链球菌属mitis群与streptococcus sanguinis亲缘关系最近，命名为cpnp，已于保藏于广东省菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 62706。2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分包括权利要求1所述的广谱抑菌性菌种cpnp或cpnp菌体胞外分泌物或培养菌株cpnp得到的菌液。3.权利要求1所述的菌株或权利要求2所述的菌剂在制备抑制致病菌株的生物制剂中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述致病菌株包括大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和/或肺炎链球菌。5.一种用于抑制致病菌株的抑菌剂，其特征在于，所述抑菌剂包含作为活性成分的权利要求1所述广谱抑菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：李新鸣，刘德峰，孙冶，李舒音，马明月，
申请(专利权)人：沈阳医学院，
类型：发明
国别省市：