一种延长秀丽线虫健康寿命的转基因质粒构建方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种延长秀丽线虫健康寿命的转基因质粒构建方法，该方法包括构建pMD18

【技术实现步骤摘要】
一种延长秀丽线虫健康寿命的转基因质粒构建方法及应用


[0001]本专利技术属于生物科学
，具体涉及一种延长秀丽线虫健康寿命的转基因质粒构建方法及应用。

技术介绍

[0002]健康长寿是人类历来追求的目标，我国虽已进入了长寿时代，但长寿而不健康的问题依然突出。健康长寿的调控机制一直是医学与生命科学领域中的研究热点。
[0003]秀丽线虫因其具有生命周期短、易于培养与观察、完整的细胞谱系、强大的遗传分析手段以及高度保守的基因组等优点，已被广泛作为模式生物用于寿命调控机制的研究，许多调控寿命的信号通路都是首先在秀丽线虫中被发现并阐明的。秀丽线虫寿命受多种因素影响：遗传因素、环境因素以及多种保守的信号转导途径，如IIS、TGF
‑
β、TOR、AMPK等。目前，延长秀丽线虫寿命的方法主要包括：低温培养、限饲、基因遗传操作等。其中基因遗传操作是通过遗传因素影响秀丽线虫寿命的方法，主要是对特定基因进行敲除或沉默，如daf
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2、hcf
‑
1、let
‑
363、daf
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种延长秀丽线虫健康寿命的转基因质粒的构建方法，其特征在于，该方法为：S1、构建pMD18
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T simple
‑
pU6::shRNA(RPS
‑
30
UbL
)质粒：S101、以pLKO.1puro质粒为模板，通过PCR扩增U6启动子序列，并通过TA克隆，将U6启动子PCR产物克隆到pMD18
‑
T simple质粒中，构建pMD18
‑
T simple
‑
pU6质粒，然后对得到的pMD18
‑
T simple
‑
pU6质粒进行AgeI/EcoRI限制性内切酶双酶切，得到AgeI/EcoRI双酶切产物，并对AgeI/EcoRI双酶切产物进行胶回收，具体的步骤包括：S1011、以pLKO.1puro质粒为模板，以上游引物U6P1和下游引物U6P2进行PCR反应扩增U6启动子，得到U6启动子PCR产物；所述上游引物U6P1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物U6P2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；PCR反应体系为：pLKO.1puro质粒0.2μL、上游引物U6P1 1μL、下游引物U6P2 1μL、LA Taq 0.25μL、10
×
LA Taq buffer 2.5μL、ddH2O补至25μL；PCR反应程序为：95℃预变性2min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，循环25次；72℃延伸5min；4℃保存；S1012、在16℃的温度条件下，通过TA克隆，将S1011中得到的U6启动子PCR产物过夜连接到pMD18
‑
T simple质粒中，得到TA克隆连接产物pMD18
‑
T simple
‑
pU6；连接反应体系：U6启动子PCR产物4μL、pMD18
‑
T simple质粒0.5μL、DNA连接缓冲液Solution I 4.5μL、ddH2O补至10μL；S1013、转化涂板：在
‑
80℃的保存温度中取出Escherichia coli TOP10感受态细菌，加入S1012中得到的TA克隆连接产物pMD18
‑
T simple
‑
pU6，混合均匀，冰浴30min然后在42℃温度下热应激90s，再冰浴2min，加入1mL LB液体培养基培养，于温度为37℃、摇床转速为250rpm/min的条件下培养1h，经离心得到转化后的残留菌液，将转化后的残留菌液滴加至含氨苄青霉素抗性的固体LB培养板中，并涂布均匀，置于温度为37℃的细菌培养箱中过夜培养；S1014、测序鉴定：在S1013中过夜培养的固体LB培养板中挑取单克隆菌落，分别置于3mL含氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，于温度为37℃、摇床转速为250rpm/min的条件下培养10h，分别取得到的菌液进行测序鉴定，筛选得到的测序结果正确的单克隆菌落；S1015、提取pMD18
‑
T simple
‑
pU6质粒：将S1014中得到的测序正确的单克隆菌落使用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit质粒提取试剂盒提取，得到pMD18
‑
T simple
‑
pU6质粒；S1016、AgeI/EcoRI限制性内切酶双酶切；在37℃的温度条件下，对S1015中得到的pMD18
‑
T simple
‑
pU6质粒进行5h AgeI/EcoRI限制性内切酶双酶切反应，得到AgeI/EcoRI双酶切产物；反应体系：pMD18
‑
T simple
‑
pU6质粒1.5μg、10
×
FastDigest Green buffer 2μL、AgeI限制性内切酶1μL、EcoRI限制性内切酶1μL、ddH2O补至20μL；S1017、胶回收AgeI/EcoRI双酶切产物：将S1016中得到的AgeI/EcoRI双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，切下270bp大小的目的DNA条带，使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit胶回收试剂盒回收，得到AgeI/EcoRI双酶切后胶回收产物；
S102、将引物UbLshR1和引物UbLshR2退火，得到退火产物，即针对RPS
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30
UbL
区域的短发夹RNA：shRNA(RPS
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30
UbL
)；所述引物UbLshR1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述引物UbLshR2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；退火体系：引物UbLshR1 1.5μL、引物UbLshR2 1.5μL、10
×
NEB buffer II 5μL、ddH2O补至50μL；退火程序：95℃预变性5min；70℃变性15min；以每秒降低0.1℃的速度降至22℃；
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40℃保存；S103、将S101中得到的AgeI/EcoRI双酶切后胶回收产物与S102中得到的退火产物连接，构建得到pMD18
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T simple
‑
pU6::shRNA(RPS
‑
30
UbL
)质粒，具体的步骤包括：S1031、在16℃的温度条件下，将S101中得到的AgeI/EcoRI双酶切后胶回收产物和S102中得到的退火产物过夜连接，得到连接产物pMD18
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T simple
‑
pU6::shRNA(RPS
‑
30
UbL
)；连接反应体系：AgeI/EcoRI双酶切后胶回收产物100ng、退火产物500ng、Ligation Mix 8μL、ddH2O补至25μL；S1032、转化涂板：在
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80℃的保存温度中取出E.coli Stbl3感受态细菌，加入S1031中得到的连接产物pMD18
‑
T simple
‑
pU6::shRNA(RPS
‑
30
UbL
)，混合均匀，冰浴30min然后在42℃温度下热应激90s，再冰浴2min，加入1mL LB液体培养基培养，于温度为37℃、摇床转速为250rpm/min的条件下培养1h，经离心得到转化后的残留菌液，将转化后的残留菌液滴加至含氨苄青霉素(Amp)抗性的固体LB培养板中，并涂布均匀，置于温度为37℃的细菌培养箱中过夜培养；S1033、测序鉴定：在S1032中过夜培养转化后的固体LB培养板中挑取单克隆菌落，分别置于3mL含氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，于温度为37℃、摇床转速为250rpm/min的条件下培养10h，分别取得到的菌液进行测序鉴定，筛选出得到的测序结果正确的单克隆菌落；S1034、提取pMD18
‑
T simple
‑
pU6::shRNA(RPS
‑
30
UbL
)质粒；将S1033中得到的测序正确的单克隆菌落使用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit质粒提取试剂盒提取，得到pMD18
‑
T simple
‑
pU6::shRNA(RPS
‑
30
UbL
)质粒；S2、构建pMD18
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T simple
‑
pRPS
‑
30::GFP::RPS
‑
30
S30
质粒：S201、以秀丽线虫基因组DNA序列为模板，通过PCR扩增rps
‑
30启动子序列，得到rps
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30启动子PCR产物；以pEGFP
‑
c2质粒为模板，通过PCR扩增GFP核酸序列，得到GFP PCR产物；以秀丽线虫RNA序列反转录获得的cDNA为模板，通过PCR扩增RPS
‑
30
S30
核酸序列，得到RPS
‑
30
S30 PCR产物，具体的步骤包括：S2011、提取秀丽线虫基因组DNA：使用提取基因组DNA的试剂盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0进行提取，得到秀丽线虫基因组DNA；S2012、以S2011中得到的秀丽线虫基因组DNA为模板，PCR扩增rps
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30启动子序列：以秀丽线虫基因组DNA为模板，以上游引物rps30P1和下游引物rps30P2进行PCR反应扩增rps
‑
30启动子序列，得到rps
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30启动子PCR产物；所述上游引物rps30P1的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述下游引物rps30P2的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；PCR反应体系：秀丽线虫基因组DNA 2μL、上游引物rps30P1 1μL、下游引物rps30P2 1μ
L、LA Taq 0.25μL、10
×
LA Taq buffer 2.5μL、ddH2O补至25μL；PCR反应程序：95℃预变性4min；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，循环28次；72℃延伸10min；4℃保存；S2013、以pEGFP
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c2质粒为模板，PCR扩增GFP核酸序列：以pEGFP
‑
c2质粒为模板，以上游引物GFP1和下游引物GFP2进行PCR反应扩增GFP核酸序列，得到GFP PCR产物；所述上游引物GFP1的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述下游引物GFP2的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；PCR反应体系：pEGFP
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c2质粒0.2μL、上游引物GFP1 1μL、下游引物GFP2 1μL、LA Taq 0.25μL、10
×
LA Taq buffer 2.5μL、ddH2O补至25μL；PCR反应程序：95℃预变性2min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，循环25次；72℃延伸5min；4℃保存；S2014、提取秀丽线虫总RNA；S2015、秀丽线虫RNA序列反转录获得cDNA；S2016、以S2015中得到的cDNA为模板，PCR扩增RPS
‑
30
S30
核酸序列，具体方法为：以S2015中得到的cDNA为模板，以上游引物s30F和下游引物s30R进行PCR反应扩增RPS
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30
S30
核酸序列，得到RPS
‑
30
S30 PCR产物；所述上游引物s30F的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述下游引物s30R的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；PCR反应体系：cDNA 2μL、上游引物s30F 1μL、下游引物s30R 1μL、LA Taq 0.25μL、10
×
LA Taq buffer 2.5μL、ddH2O补至25μL；PCR反应程序：95℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，循环25次；72℃延伸5min；4℃保存；S202、通过TA克隆分别将S2012中得到的rps
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30启动子PCR产物、GFP PCR产物和RPS
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30
S30 PCR产物连接到pMD18
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T simple质粒中，并进行测序鉴定，提取得到pMD18
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T simple
‑
pRPS
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30质粒、pMD18
‑
T simple
‑
GFP质粒和pMD18
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T simple
‑
RPS
‑
30
S30
质粒，具体的步骤包括：S2021、在16℃的温度条件下，通过TA克隆将S201中得到的rps
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30启动子PCR产物过夜连接到pMD18
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T simple质粒中，得到连接产物pMD18
‑
T simple
‑
pRPS
‑
30；在16℃的温度条件下，通过TA克隆将S2013中得到的GFP PCR产物过夜连接到pMD18
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T simple质粒中，得到连接产物pMD18
‑
T simple
‑
GFP；在16℃的温度条件下，通过TA克隆将S2016中得到的RPS
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30
S30 PCR产物分别过夜连接到pMD18
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T simple质粒中，得到连接产物pMD18
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T simple
‑
RPS
‑
30
S30
；连接反应体系：PCR产物4μL、pMD18
‑
T simple质粒0.5μL、DNA连接缓冲液Solution
Ⅰꢀ
4.5μL、ddH2O补至10μL；所述PCR产物为rps
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30启动子PCR产物或GFP PCR产物或RPS
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30
S30 PCR产物；S2022、转化涂板：在
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80℃的保存温度中取出3支Escherichia coli TOP10感受态细菌，第一支Escherichia coli TOP10感受态细菌中加入S2021中得到的连接产物pMD18
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T simple
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pRPS
‑
30，第二支Escherichia coliTOP10感受态细菌中加入S2021中得到的连接产物pMD18
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T simple
‑
GFP，第三支E.coli TOP10感受态细菌中加入S2021中得到的连接产物
pMD18
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T simple
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RPS
‑
30
S30
，分别混合均匀后，冰浴30min，然后在42℃温度下热应激90s，再冰浴2min，加入1mL LB液体培养基培养，于温度为37℃、摇床转速为250rpm/min的条件下培养1h，经离心得到转化后的残留菌液，将转化后的残留菌液滴加至含氨苄青霉素抗性的固体LB培养板中，并涂布均匀，置于温度为37℃的细菌培养箱中过夜培养；S2023、测序鉴定：在S2022中过夜培养的固体LB培养板中分别挑取单克隆菌落，然后分别置于3mL含氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，于温度为37℃、摇床转速为250rpm/min的条件下培养10h，分别取得到的菌液进行测序鉴定，筛选出得到的测序结果正确的单克隆菌落；S2024、提取pMD18
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T simple
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pRPS
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30质粒、pMD18
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T simple
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GFP质粒和pMD18
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T simple
‑
RPS
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30
S30
质粒：将S2023中得到的测序正确的单克隆菌落使用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit质粒提取试剂盒提取，分别得到pMD18
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T simple
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pRPS
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30质粒、pMD18
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T simple
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GFP质粒和pMD18
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T simple
‑
RPS
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30
S30
质粒；S203、将S2024中得到的pMD18
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T simple
‑
pRPS
‑
30质粒和pMD18
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T simple
‑
RPS
‑
30
S30
质粒分别进行NheI/EcoRI限制性内切酶双酶切，胶回收得到NheI/EcoRI双酶切后胶回收产物，连接NheI/EcoRI双酶切胶回收产物，构建得到pMD18
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T simple
‑
pRPS
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30::RPS
‑
30
S30
质粒，具体的步骤包括：S2031、NheI/EcoRI限制性内切酶双酶切；在37℃的温度条件下，用NheI/EcoRI限制性内切酶对S2024中得到的pMD18
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T simple
‑
pRPS
‑
30质粒进行5h的双酶切反应，得到pMD18
‑
T simple
‑
pRPS
‑
30质粒NheI/EcoRI双酶切产物；在37℃的温度条件下，用NheI/EcoRI限制性内切酶对S2024中得到的pMD18
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T simple
‑
RPS
‑
30
S30
质粒进行5h的双酶切反应，得到pMD18
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T simple
‑
RPS
‑
30
S30
质粒NheI/EcoRI双酶切产物；反应体系：pMD18
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T simple
‑
pRPS
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30质粒或pMD18
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T simple
‑
RPS
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30
S30
质粒1.5μg、10
×
FastDigest Green buffer 2μL、NheI限制性内切酶1μL、EcoRI限制性内切酶1μL、ddH2O补至20μL；S2032、胶回收NheI/EcoRI双酶切产物：将S2031中得到的pMD18
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T simple
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pRPS
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30质粒NheI/EcoRI双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，切下4400bp大小的目的DNA条带，并使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit胶回收试剂盒回收，得到pMD18
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T simple
‑
pRPS
‑
30质粒NheI/EcoRI双酶切后胶回收产物；将S2031中得到的pMD18
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T simple
‑
RPS
‑
30
S30
质粒NheI/EcoRI双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，切下180bp大小的目的DNA条带，并使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit胶回收试剂盒回收，得到pMD18
‑
Tsimple
‑
RPS
‑
30
S30
质粒NheI/EcoRI双酶切后胶回收产物；S2033、在16℃的温度条件下，将S2032中得到的pMD18
‑
T simple
‑
pRPS
‑
30质粒NheI/EcoRI双酶切后胶回收产物和pMD18
‑
T simple
‑
RPS
‑
30
S30
质粒NheI/EcoRI双酶切后胶回收产物过夜连接，得到NheI/EcoRI双酶切后胶回收产物的连接产物：连接反应体系：pMD18
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T simple
‑
pRPS
‑
30质粒NheI/EcoRI双酶切后胶回收产物100ng、pMD18
‑
T simple
‑
RPS
‑
30
S30
质粒NheI/EcoRI双酶切后胶回收产物500ng、Ligation Mix 8μ
L、ddH2O补至25μL；S2034、转化涂板：在
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80℃的保存温度中取出Escherichia coli TOP10感受态细菌，加入S2033中得到的NheI/EcoRI双酶切后胶回收产物的连接产物，混合均匀，冰浴30min然...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫宝龙，孙委委，梁韶晖，黄慧聪，姜婷，周坤铮，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：