一种减少CRISPRCas9脱靶效应的方法技术

本发明专利技术公开了一种减少CRISPRCas9脱靶效应的方法，CRISPR/Cas9体系中的sgRNA通过Spacer部分20bp长度的碱基通过互补配对形成RNA

【技术实现步骤摘要】
一种减少CRISPRCas9脱靶效应的方法


[0001]本专利技术涉及基因治疗
，具体为一种减少CRISPRCas9脱靶效应的方法。

技术介绍

[0002]CRISPR
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Cas系统是细菌和古细菌中的自适应免疫系统，并且已被改造成强大的基因编辑工具。第I类CRISPR
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Cas系统使用多蛋白复合物靶向核酸，而第II类系统使用单个Cas蛋白即可发挥作用。由于该体系较为简单，将CRISPR
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Cas系统用于基因编辑的工作主要集中在II类CRISPR系统上。人们可以很容易地对其进行加以改造以适用于各种应用。
[0003]病毒和原核生物之间的竞争导致Cas相关蛋白在不同的细菌中拥有各种各样的类型。每种Cas蛋白都有其独特的性质(例如核酸序列的偏好性，原前间隔序列临近基序(PAM)要求不同，Cas蛋白大小不一)，将其加以应用时各有优缺点。因此，对第II类CRISPR系统的鉴定和表征是一个热门的研究领域，其首要目标是寻找具有特殊功能或改良特性的Cas蛋白。
[0004]尽管这些核酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种减少CRISPRCas9脱靶效应的方法，其特征在于，其方法包括如下步骤：(1)CRISPR/Cas9体系中的sgRNA通过Spacer部分20bp长度的碱基通过互补配对形成RNA
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DNA duplex识别靶向DNA序列；(2)结合了sgRNA的Cas9蛋白沿着DNA双链搜寻NGG时，RNA
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DNA会形成一个类似“R
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loop”的结构，并从1位碱基开始配对；(2.1)配对成功则沿着链一直配对至20bp，完全互补配对后则会形成稳定的RNA
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DNA duplex进而激活Cas9的HNH和RuvC核酸酶结构域；(2.2)如果中间出现碱基不匹配的情况，RNA
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DNA duplex将解离，而sgRNA
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Cas9蛋白复合物会继续寻找下一个PAM位点，直至找到正确的靶点配对成功。(3)通过调控“Stem”部分长度可以影响sgRNA活性，根据不同的序列选择适当的长度，使其依旧保持sgRNA的靶向功能，再与不改造的sgRNA对比，观察有无改善脱靶效应；(4)将200ng的含EGFP基因的质粒与50nM sgRNA、50nM Cas9酶在1
×
Cas9 bTffer中37℃孵育30min，加入1μL Proteinase K继续孵育10min以消化Cas9蛋白，加入DNA loading buffer后将反应溶液加入到制备好的1％琼脂糖凝胶中，在1
×
TAE缓冲液中室温140V恒压电泳30min，取出放入凝胶成像仪观察质粒切割情况；(5)转录stem
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4bp
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stem
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20bp的十二条sgRNA，纯化后通过含7M尿素的6％聚丙烯酰胺凝胶确认sgRNA的纯度；(6)对胶图上的条带分别进行定量，通过在sgRNA的5
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端延伸使其形成分子内发卡结构，sgRNA与靶向DNA配对时形成RNA
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DNA duplex与hairpin
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sgRNA存在相互竞争关系；(6.1)当配对数较少时，随着RNA
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DNA duplex从sgRNA的20位碱基开始延伸，hairpin
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sgRNA的loop结构被打开，最终20bp的RNA
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DNA duplex完全形成，激活Cas9酶，此时stem部分序列变成单链RNA游离在RNA
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DNA duplex之外；(6.2)如果配对数增多，已经形成的RNA
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DNA duplex稳定性不足以将hairpin
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sgRNA的loop结构打开，那么20bp的完整RNA
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DNA duplex将不能形成，无法激活Cas9。(7)在细胞内，CRISPR/Cas9的脱靶序列是通过计算机模拟计算出来的，再通过对潜在脱靶位置进行测序对比control组和实验组，即可确定实验体系是否存在脱靶效应，以及各位点脱靶的频率，在体外通过分子克隆对相应的靶标序列做定点突变，即可得到带有不同靶向序列的质粒；(8)使用双质粒系统，一个质粒以U6作为启动子表达sgRNA，另一个质粒则依靠CMV作为启动子表达Cas9蛋白，按一定比例同时转...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐亮，刘彦，王阳，张秋龙，王亮亮，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：