一种共表达马立克病病毒糖蛋白gC和gD的DNA疫苗构建方法技术

本发明专利技术公开了一种共表达马立克病病毒糖蛋白gC和gD的DNA疫苗构建方法。属于DNA分子疫苗技术领域。包括：马立克病病毒糖蛋白gC和gD基因、IL

【技术实现步骤摘要】
一种共表达马立克病病毒糖蛋白gC和gD的DNA疫苗构建方法


[0001]本专利技术涉及DNA分子疫苗
，更具体的说是涉及一种共表达马立克病病毒糖蛋白gC和gD的DNA疫苗构建方法。

技术介绍

[0002]马立克病(Marek
’
s disease,MD)是鸡的一种常见的T淋巴细胞增生性肿瘤病，由高度细胞结合性的α
‑
疱疹病毒马立克病病毒(Marek
’
s disease virus,MDV)感染引起，主要的特征性病理变化为单核细胞浸润外周神经、虹膜、皮肤组织和其它实质内脏器官，病鸡表现为快速形成淋巴样肿瘤，免疫抑制和麻痹。MDV是有囊膜的双股线性DNA病毒，基因组长度约为170kbp，包含338个开放阅读框(Openreading frame,ORF)，其中103个可能是功能基因，编码的病毒蛋白超过60个，研究较多的有致瘤蛋白Meq、pp38和v
‑
IL8，以及与病毒入侵和传播相关的囊膜糖蛋白gB、gC、gE、gI、gM等。
[0003]传统的MD疫苗主要以参与病毒复制的蛋白为靶点，不能诱导产生中和免疫，因此存活下来的野生型毒株可能容易发生变异，致使毒力逐渐增强。尽管疫苗仍然是目前防控MD的有效手段之一，但近年来特超强MDV毒株(Very virulentplus MDV,vv+MDV)的不断出现，突破了现有最好疫苗的保护作用，导致越来越多的鸡群感染MDV，包括种鸡、蛋鸡以及我国南方地区长期饲养的优质鸡，给我国养鸡业构成了不容忽视的威胁。此外，多联苗的使用会导致B淋巴细胞机能障碍，造成鸡群免疫力下降。除火鸡疱疹病毒以外，其它MD疫苗均有严格的活细胞结合性，必须用液氮保存，增加了疫苗的运输成本。
[0004]因此，利用基因重组技术研制新型MD疫苗有望弥补现有疫苗的不足，提高鸡群抵抗MD的能力，提升养殖效益。
[0005]MDV编码的糖蛋白C(Glycoprotein C,gC)是作为α
‑
疱疹病毒亚科的一种多功能蛋白，由甲型疱疹病毒UL44的同源基因编码合成，与病毒的附着、稳定性和毒力有关。已有研究证实gC与MDV的水平传播密切相关，缺失gC基因的病毒突变体其水平传播能力显著下降。糖蛋白D(Glycoprotein D,gD)也是疱疹病毒家族的最保守糖蛋白之一，由US6基因编码产生，在病毒入侵机体的过程中除与细胞受体(NECTIN
‑
1或HVEM)发生结合外，还会激活病毒融合装置的下游组分。同时，gD具有较高的免疫原性。
[0006]虽然糖蛋白gC和gD在MD致病过程中发挥重要作用，但目前广泛使用的商品弱毒疫苗(如CVI988、814株等)感染细胞后产生的结合型gC表达量很低，也几乎检测不到gD表达。现有MD弱毒疫苗的重要缺陷之一就是不能提供完全保护，即无法阻止病毒感染和机体排毒。这可能与关键糖蛋白gC和gD非正常表达，导致针对gC和gD的免疫反应不足有密切联系。
[0007]白细胞介素
‑
18(IL
‑
18)是由巨噬细胞产生的一种重要的细胞因子，在先天性免疫与获得性免疫中发挥重要的作用，可在DNA疫苗中起佐剂作用增强体液和细胞免疫应答。温纳相(2003)曾将表达pcDNA3.1/ChIL
‑
18DNA疫苗和新城疫灭活苗联合注射鸡只，结果显示，用常规ND灭活苗与ChIL
‑
18基因重组真核表达质粒联合注射，比只用常规ND灭活苗免疫鸡T淋巴细胞转化功能有明显提高。
[0008]重组DNA疫苗是通过将外源基因克隆入真核表达载体中，将重组质粒注射到动物体内，使外源基因在机体内表达形成抗原，诱导机体产生免疫反应。与传统的灭活疫苗相比，重组DNA疫苗不仅能诱导机体的体液免疫应答，而且能诱导机体产生细胞免疫应答。与传统的弱毒活疫苗相比，重组DNA疫苗具有安全、成本低、易保存、制备简单的优点。
[0009]因此，如何提供一种共表达马立克病病毒糖蛋白gC和gD的DNA疫苗构建方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0010]有鉴于此，本专利技术提供了一种共表达马立克病病毒糖蛋白gC和gD的DNA疫苗构建方法。得到的疫苗具有安全性高、成本低廉、制作简单、易保存、免疫效果较好的的特点。
[0011]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0012]一种共表达马立克病病毒糖蛋白gC和gD的DNA重组质粒，包括：马立克病病毒糖蛋白gC和gD基因、IL
‑
18基因、自裂解多肽P2A和T2A、真核表达载体组成。
[0013]优选的：IL
‑
18基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；gC基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；gD基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；真核表达载体为pVAX1
‑3×
MCS，包括HA、6
×
His、FLAG标签及自裂解多肽P2A、T2A序列，自裂解多肽P2A的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；T2A的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
[0014]有益效果在于：在pVAX1
‑3×
MCS的多克隆酶切位点插入自裂解多肽P2A和T2A，利用共同的CMV启动子驱动gC与gD蛋白、IL
‑
18蛋白独立且等量表达。
[0015]优选的：通过体外同源重组的方式，将PCR扩增出的gC、gD和IL
‑
18基因片段插入到真核表达载pVAX1
‑3×
MCS。
[0016]有益技术效果：表达马立克病病毒糖蛋白gC
‑
gD的DNA重组质粒，可以表达多个糖蛋白，以弥补现有疫苗糖蛋白表达不足；在表达两个马立克病毒糖蛋白基因时，加入鸡白细胞介素
‑
18基因，以提高免疫应答效果。
[0017]本专利技术还提供了上述任一的重组质粒的构建方法，包括以下步骤：
[0018]1)通过PCR扩增马立克病毒糖蛋白gC、gD基因和IL
‑
18基因；
[0019]2)使用限制性内切酶BgIⅡ、HindⅢ、BamHⅠ依次将真核表达载体进行单酶切线性化；
[0020]3)通过同源重组方式将步骤1)gC、gD基因和IL
‑
18基因连接至真核表达载体载体上，在gC与IL
‑
18之间插入P2A、IL
‑
18与gD之间插入T2A形成重组质粒。
[0021]有益效果在于，gC、gD、IL
‑
18基因在CMV驱动下表达，开放阅读框由P2A序列将gC与IL
‑
18串联起来、T2A序列将IL
‑
18与gD串联起来，即得到表达马立克病病毒糖蛋白gC
‑
gD的DNA重组质粒pVAXl
‑
gC
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种共表达马立克病病毒糖蛋白gC和gD的DNA重组质粒，其特征在于，包括：马立克病病毒糖蛋白gC和gD基因、IL
‑
18基因、自裂解多肽P2A和T2A、真核表达载体组成。2.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述IL
‑
18基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述gC基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述gD基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述真核表达载体为pVAX1
‑3×
MCS，包括HA、6
×
His、FLAG标签及自裂解多肽P2A、T2A序列，所述自裂解多肽P2A的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述T2A的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。3.如权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，通过体外同源重组的方式，将PCR扩增出的gC、gD和IL
‑
18基因片段插入到真核表达载pVAX1
‑3×
MCS。4.权利要求1～3任一所述的重组质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)通过PCR扩增马立克病毒糖蛋白gC、gD基因和IL
‑
18基因；2)使用限制性内切酶BgIⅡ、HindⅢ、BamHⅠ依次将真核表达载体进行单酶切线性化；3)通过同源重组方式将步骤1)gC、gD基因和IL
‑
18基因连接至真核表达载体载体上，在gC与IL
‑
18...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄腾，徐贝贝，秦可，张金城，陈鑫，冯伟民，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：