Bhlhe40基因在调控骨髓间充质干细胞增殖、分化和衰老中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种转录因子Bhlhe40在小鼠BMSCs的PαS细胞亚群中增殖、分化和衰老的应用。本发明专利技术发现转录因子Bhlhe40在PαS细胞的体外培养过程中具有促进细胞增殖、成骨和成软骨向分化和延缓衰老、抑制成脂向分化的作用。基于Bhlhe40在PαS细胞中的作用，可以研发靶向或促进Bhlhe40表达的小分子药物，使得新鲜分离的原代细胞在体外扩增过程中，能够最大程度促进细胞增殖，调控细胞分化、延缓细胞衰老，突破临床转化应用的瓶颈，且有助于干细胞产业化的进程。化的进程。化的进程。

【技术实现步骤摘要】
Bhlhe40基因在调控骨髓间充质干细胞增殖、分化和衰老中的应用


[0001]本申请涉及基因的功能与应用
，具体而言，涉及螺旋
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环
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螺旋家族成员e40(basic helix
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loop
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helix family，member e40，Bhlhe40)作为靶基因在调控干细胞增殖、分化和衰老中的应用。

技术介绍

[0002]骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)因其再生能力强、免疫原性低的特点，使其在组织工程和细胞治疗中具有巨大的应用潜力。目前BMSCs在临床应用上的一个瓶颈是体内BMSCs数量少，在体内仅占骨髓内单核细胞数量的十万分之一，因此需要先在体外进行培养扩增以获得足够数目的BMSCs。BMSCs在体外扩增培养的过程中，干细胞的干性会逐渐降低，即干细胞的增殖和多向分化能力逐渐减弱。BMSCs干性的降低会影响其在组织工程和细胞治疗过程中的效果，因此在BMSCs体外扩增的过程中维持细胞干性对于其临床应用有巨大意义。
[0003]有研究分别使用未培养的、培养24小时、培养48小时的小鼠BMSCs注射到亚致死性照射的小鼠骨髓内，72小时后提取骨髓和脾脏中的基质细胞，发现仅培养24小时就显著降低了骨髓和脾脏中MSCs的接种效率，而培养48小时后，在这些器官中未检测到供体来源的BMSCs。另有研究表明，使用原代而非培养后的BMSCs和造血干细胞在亚致死性照射的小鼠骨髓内共移植可以更好的重建骨髓基质的功能。以上研究表明体内和体外BMSCs之间存在较大的生物学特性差异。因此，了解体内、外BMSCs的干性差异，有助于在体外扩增培养时维持BMSCs的干性。
[0004]BMSCs是具有异质性的细胞群，可能含有不同功能的细胞亚群，因此挑选出最具增殖和分化潜能的BMSCs作为种子细胞更有利于体外扩增培养过程。有研究表明，与小鼠体内分离的其他BMSCs相比，PαS细胞(小鼠PαS细胞(murine bone marrow
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derived PDGFRα+SCA
‑
1+CD45
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TER119
‑
mesenchymal stromal cells))具有更强的生长潜能和三系分化能力，因此挑选PαS细胞作为种子细胞更有利于体外培养扩增过程。
[0005]传统的BMSCs分离方法主要通过细胞贴壁培养和更换培养基去除不贴壁的细胞，然而这种分离小鼠BMSCs的方法存在一些局限性，比如其得到的细胞可能含有其他杂细胞。之前研究报道通过FACS(流式细胞荧光分选技术)可以获得更纯的PαS细胞，其分选的Marker为CD140a
+
SCA
‑1+
CD45
‑
TER119
‑
，因此采用这种方式获得Fresh PαS细胞。干细胞供体的年龄对干细胞的数目和干性有很大的影响，之前有研究比较4种不同供体年龄的C57小鼠长骨中PαS细胞的比例，研究发现出生后1
‑
3天和胚胎第18.5天的C57小鼠四肢中含有较高比例的PαS细胞。因此综合实验操作的难度、实验花费以及提取细胞数量等因素考虑，选取出生后1
‑
3天的C57乳鼠进行PαS细胞的提取。
[0006]目前，Bhlhe40在肿瘤细胞、免疫细胞中的周期调控、新陈代谢、细胞凋亡、免疫调控等作用被广泛报道，但还未有研究报道Bhlhe40在促进PaS细胞增殖、调控PαS细胞分化和
延缓PαS细胞衰老中的作用。

技术实现思路

[0007]通过比较Fresh PαS细胞和P0代PαS细胞的RNA
‑
Seq数据，发现转录因子Bhlhe40在P0代PαS细胞中的表达程度显著低于Fresh PαS细胞。此外，通过比较P0代、P1代和P4代PαS细胞的RNA
‑
Seq数据，同样发现Bhlhe40在P4代PαS细胞中的表达水平显著低于P0代和P1代PαS细胞。进一步研究发现，Bhlhe40基因具有促进干细胞增殖、调控干细胞分化和延缓干细胞衰老的作用。
[0008]基于以上研究，本专利技术提供了一种Bhlhe40基因在调控骨髓间充质干细胞增殖、分化或衰老中的应用。
[0009]进一步的，通过使所述骨髓间充质干细胞中的所述Bhlhe40基因过表达来促进所述干细胞增殖、调控干细胞分化或延缓其衰老。
[0010]所述应用为Bhlhe40基因在制备促进干细胞增殖、调控干细胞分化和延缓干细胞衰老的药物中的应用。
[0011]所述骨髓间充质干细胞为PαS细胞。
[0012]本专利技术还提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒能够过表达Bhlhe40基因。
[0013]进一步的，所述Bhlhe40基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0014]本专利技术提供了一种重组骨髓间充质干细胞，所述重组骨髓间充质干细胞是通过将Bhlhe40基因转染到骨髓间充质干细胞中获得，能够过表达所述Bhlhe40基因。
[0015]进一步的，所述骨髓间充质干细胞为PαS细胞。
[0016]将前述的重组慢病毒感染骨髓间充质干细胞获得所述重组骨髓间充质干细胞。
[0017]本专利技术的有益效果包括：本专利技术发现Bhlhe40基因的新功能，即Bhlhe40基因具有促进干细胞增殖、调控干细胞分化和延缓干细胞衰老的作用。基于Bhlhe40在促进干细胞增殖、调控干细胞分化和延缓干细胞衰老的作用，其可用于制备促进干细胞增殖、调控干细胞分化和延缓干细胞衰老的作用的药物。BHLHE40蛋白本身分子体积小，化学结构简单，因此，药理功能更安全、药效更温和且副作用更少，故BHLHE40在干细胞治疗和组织工程再生中具有广阔的开发应用前景。
附图说明
[0018]图1是过表达Bhlhe40促进体外培养的PαS细胞的增殖能力的结果图；其中，(a)为Bhlhe40过表达PαS细胞(Bhlhe40)和对照组PαS细胞(Vector)的镜下形态；(b)为Bhlhe40和Vector的CCK8检测结果；(c)为Bhlhe40和Vector的单细胞克隆形成情况；(d)为Bhlhe40和Vector的多细胞克隆形成情况(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)；
[0019]图2是过表达Bhlhe40促进体外培养的PαS细胞的成骨和成软骨向分化，抑制成脂向分化的染色结果图；其中，(a)为Bhlhe40和Vector的ALP染色和活性定量检测结果；(b)为Bhlhe40和Vector的ARS染色和定量检测结果；(c)为Bhlhe40和Vector在PM(增殖培养基)条件下油红O染色和定量检测结果；(d)为Bhlhe40和Vector在AM条件下油红O染色和定量检测结果；(e)为Bhlhe40和Vector孔板阿尔新蓝染色情况；(f本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.Bhlhe40基因在调控骨髓间充质干细胞增殖、分化或衰老中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过使所述骨髓间充质干细胞中的所述Bhlhe40基因过表达来促进所述干细胞增殖、调控干细胞分化或延缓其衰老。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述应用为Bhlhe40基因在制备促进干细胞增殖、调控干细胞分化和延缓干细胞衰老的药物中的应用。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞为PαS细胞。5.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒能够过表达Bhlhe40基因。...

【专利技术属性】
技术研发人员：周永胜，张萍，胡孟龙，田月明，
申请(专利权)人：北京大学口腔医学院，
类型：发明
国别省市：