一种BCR-ABL突变工程细胞及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种BCR

【技术实现步骤摘要】
一种BCR
‑
ABL突变工程细胞及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种BCR
‑
ABL突变工程细胞及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]慢性粒细胞白血病(简称慢粒)，也被称为慢性髓性白血病(Chronic myelogenous leukemia，CML)，其典型表现为白细胞增高和脾脏肿大。1960年科学家在该病患细胞中发现了费城染色体，该染色体是由9号与22号染色体易位形成的，这种易位导致了9号染色体BCR和22号染色体ABL基因融合。BCR
‑
ABL融合基因编码了BCR
‑
ABL融合蛋白，又根据融合位点差异，主要分为P210KD、P190KD和P230KD三种。BCR
‑
ABL作为一种融合基因，它定位在细胞质内，融合后非受体酪氨酸激酶ABL蛋白N端的肉豆蔻酰肽丢失，致使了ABL激酶域上的变构位点缺失，进一步导致了SH3、SH2与激酶域无法交联抑制自身活性，于是BCR
‑
ABL激酶持续激活。这种异常激活，驱动了ABL下游RAS、PI3K/AKT、JAK/STAT等多条信号通路，使得正常细胞恶性转化及增殖，造血细胞失去正常的凋亡功能，不再依赖于造血生长因子等，进而促使肿瘤的发生发展。BCR
‑
ABL已经在20～30％的ALL及超过90％的CML患者中检测到，其也被作为白血病尤其是慢性粒细胞白血病的重要治疗靶点。
[0003]在首次发现慢粒之后的百余年间，其治疗药物从砷剂、脾区照射发展到白消安、羟基脲、干扰素、骨髓移植等，直到人们发现BCR
‑
ABL在慢粒发病机制中的关键意义，科学家们开始研究小分子药物用于慢粒的治疗，最终专利技术了酪氨酸激酶抑制剂(TKI)靶向药物。至今为止，已有多种TKI批准上市并允许运用在CML的治疗中，且证实可使患者长期总生存率达90％。包括BCR
‑
ABL的第一代的TKI—Imatinib(伊马替尼，2001上市)，作为一线治疗选择，显著提高了患者生存率；第二代TKI—Dashatinib(达沙替尼，2006上市)、Nilotinib(尼洛替尼，2007上市)等，它们能克服除T315I以外的大部分突变(L248V、G250E、Q252H等)，从而解决了Imatinib治疗过程中由靶蛋白编码基因突变导致的BCR
‑
ABL依赖性耐药；但随着T315I位点突变的出现，病患对第二代药物重新出现耐药；经过研发，第三代TKI—Ponatinib(普纳替尼，2012上市)，它能克服包括T315I在内的多种突变，给病患带来福音，但随着BCR
‑
ABL基因新位点的突变等原因，对第三代TKI
‑
Ponatinib耐药的现象在临床上重新出现；2021年，第四代TKI—Asciminib(Scemblix，ABL
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001)上市，它区别于前三代ATP竞争性抑制剂，是一种变构抑制剂，可以通过改变蛋白结构进而影响蛋白功能，其也能克服包括T315I在内的多种突变绝大多数患者都可以回归正常的工作和生活。但遗憾的是仍有一部分患者不能达到理想缓解效果(原发性耐药)或缓解后复发(继发性耐药)。耐药机制可分为BCR
‑
ABL依赖性和非依赖性，其中主要为BCR
‑
ABL依赖性耐药，这可能由于基因突变导致了自身蛋白构象改变，拥有空间位阻或形成其它区域结合了TKI。而对于是否由这些突变类型引发了耐药，是否有其它用药方式可以克服这些突变尚不清楚，这就需要有携带这些突变的工程细胞株作为模型进行科学研究。
[0004]携带特定癌基因的工程细胞株的构建与筛选并不容易，提高工程细胞株的构建和
筛选效率是研究特定癌基因的重要内容之一，一种好的构建与筛选方式可以节省大量成本，提高科学研究速率；同时，BCR
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ABL工程细胞的成功构建，可以为BCR
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ABL靶向药物的开发及测试提供便利；也可作为新的靶向药的大规模筛选提供筛选平台。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供了一种BCR
‑
ABL突变工程细胞及其构建方法与应用。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种BCR
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ABL突变工程细胞的构建方法，包括以下步骤：
[0008](1)构建pCDH
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BCR
‑
ABL
‑
WT野生型质粒；
[0009](2)采用重叠PCR扩增BCR
‑
ABL突变片段；
[0010](3)将步骤(2)得到的BCR
‑
ABL突变片段和pCDH
‑
BCR
‑
ABL
‑
WT质粒双酶切后连接，得到BCR
‑
ABL点突变质粒；
[0011](4)将步骤(3)得到的BCR
‑
ABL点突变质粒包装慢病毒后感染宿主细胞，得到BCR
‑
ABL突变工程细胞。
[0012]优选的，所述BCR
‑
ABL点突变质粒包括BCR
‑
ABL
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T315L、BCR
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ABL
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T315Y、BCR
‑
ABL
‑
T315I、BCR
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ABL
‑
Q252H/Y253H、BCR
‑
ABL
‑
Y253H/E255K、BCR
‑
ABL
‑
Q252H/T315I、BCR
‑
ABL
‑
Y253H/F317I、BCR
‑
ABL
‑
T315I/F359V、BCR
‑
ABL
‑
D276G/T315L或BCR
‑
ABL
‑
T315L/T319S点突变质粒。
[0013]优选的，当所述BCR
‑
ABL点突变质粒包括BCR
‑
ABL
‑
T315L、BCR
‑
ABL
‑
T315Y、BCR
‑
ABL
‑
T315I、BCR
‑
ABL
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Q252H/Y253H、BCR
‑
ABL
‑
Y253H/E255K或BCR
‑
ABL
‑
T315L/T319S时，所述重叠PCR进行一次重叠PCR扩增，包括第一轮PCR和第二轮PCR；第一轮PCR分别扩增突本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种BCR
‑
ABL突变工程细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建pCDH
‑
BCR
‑
ABL
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WT野生型质粒；(2)采用重叠PCR扩增BCR
‑
ABL突变片段；(3)将步骤(2)得到的BCR
‑
ABL突变片段和步骤(1)得到的pCDH
‑
BCR
‑
ABL
‑
WT野生型质粒双酶切后连接，得到BCR
‑
ABL点突变质粒；(4)将步骤(3)得到的BCR
‑
ABL点突变质粒包装慢病毒后感染宿主细胞得到BCR
‑
ABL突变工程细胞。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述BCR
‑
ABL点突变质粒包括BCR
‑
ABL
‑
T315L、BCR
‑
ABL
‑
T315Y、BCR
‑
ABL
‑
T315I、BCR
‑
ABL
‑
Q252H/Y253H、BCR
‑
ABL
‑
Y253H/E255K、BCR
‑
ABL
‑
Q252H/T315I、BCR
‑
ABL
‑
Y253H/F317I、BCR
‑
ABL
‑
T315I/F359V、BCR
‑
ABL
‑
D276G/T315L或BCR
‑
ABL
‑
T315L/T319S点突变质粒。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，当所述BCR
‑
ABL点突变质粒包括BCR
‑
ABL
‑
T315L、BCR
‑
ABL
‑
T315Y、BCR
‑
ABL
‑
T315I、BCR
‑
ABL
‑
Q252H/Y253H、BCR
‑
ABL
‑
Y253H/E255K或BCR
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ABL
‑
T315L/T319S时，所述重叠PCR进行一次重叠PCR扩增，包括第一轮PCR和第二轮PCR；第一轮PCR分别扩增突变片段Ⅰ和突变片段Ⅱ，所述突变片段Ⅰ以pCDH
‑
BCR
‑
ABL
‑
WT为模板，通过上下游引物BCR
‑
ABL
‑
BamHI
‑
F/BCR
‑
ABL
‑
MUTATION
‑
R扩增得到；所述突变片段Ⅱ以pCDH
‑
BCR
‑
ABL
‑
WT为模板，通过上下游引物BCR
‑
ABL
‑
MUTATION
‑
F/BCR
‑
ABL
‑
NotI
‑
R扩增得到；所述第二轮PCR以突变片段Ⅰ和突变片段Ⅱ为模板，通过上下游引物BCR
‑
ABL
‑
BamHI
‑
F/BCR
‑
ABL
‑
NotI
‑
R扩增得到，得到BCR
‑
ABL突变片段。4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，当所述BCR
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ABL点突变质粒包括BCR
‑
ABL
‑
Q252H/T315I、BCR
‑
ABL
‑
Y253H/F317I、BCR
‑
ABL
‑
T315I/F359V或BCR
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ABL
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D276G/T315L时，所述重叠PCR进行两次重叠PCR扩增；其中，第一次重叠PCR分别扩增BCR
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ABL
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Q252H、BCR
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ABL
‑
Y253H、BCR
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ABL
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T315I和BCR
‑
ABL
‑
D276G，第一次重叠PCR包括第一轮PCR和第二轮PCR；第一轮PCR分别扩增突变片段Ⅰ和突变片段Ⅱ，所述突变片段Ⅰ以pCDH
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BCR
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ABL
‑
WT为模板，通过上下游引物BCR
‑
ABL
‑
BamHI
‑
F/BCR
‑
ABL
‑
MUTATION
‑
R扩增得到；所述突变片段Ⅱ以pCDH
‑
BCR
‑
ABL
‑
WT为模板，通过上下游引物BCR
‑
ABL
‑
MUTATION
‑
F/BCR
‑
ABL
‑
NotI
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R扩增得到；所述第二轮PCR以突变片段Ⅰ和突变片段Ⅱ为模板，通过上下游引物BCR
‑
ABL
‑
BamHI
‑
F/BCR
‑
ABL
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NotI
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R扩增得到，得到突变片段Ⅲ；第二次重叠PCR扩增包括第一轮PCR和第二轮PCR；第一轮PCR分别扩增突变片段Ⅳ和突变片段
Ⅴ
，所述突变片段Ⅳ以所述突变片段Ⅲ为模板，通过上下游引物BCR
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ABL
‑
BamHI
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F/BCR

【专利技术属性】
技术研发人员：邵焕杰，石添予，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：