一种重组人源化胶原蛋白的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种重组人源化胶原蛋白的制备方法，包括以下方法步骤，S1，将毕赤酵母菌基因工程菌接种于种子罐中培养，待溶氧大幅度回升后转移至生产发酵罐；S2，将生产发酵罐内的毕赤酵母菌基因工程菌培养至溶氧大幅度回升后，使用复合原料进行混合碳源补料；S3，结束混合碳源补料后，使用发酵液进行补料并持续进行发酵处理，发酵过程中保持注入补料气体，保持300ml/min注入；S4，使用缓冲液进行混合，然后进行提纯处理；S5，对提纯后的原料进行消毒处理。本发明专利技术大幅度减小了原料的用量，且促进了毕赤酵母菌体的生长，缩短了发酵周期，同时增加了重组人源化胶原蛋白的表达量，通过特殊的补料方式调节原料的代谢途径，有效减少重组人源化胶原蛋白的降解。人源化胶原蛋白的降解。

【技术实现步骤摘要】
一种重组人源化胶原蛋白的制备方法


[0001]本专利技术涉及基因重组高密度发酵
，尤其是一种重组人源化胶原蛋白的制备方法。

技术介绍

[0002]胶原蛋白与人体皮肤胶原的结构高度相似，为非水溶性纤维状含糖蛋白质，分子中富含大量氨基酸和亲水基，具有一定的表面活性和很好的相容性。同时由于胶原蛋白分子中含有大量的羟基，使胶原分子极易与水形成氢键，可以结合大量的水，因此它有着相当好的保湿作用。在相对湿度70％时，仍可保持其自身重量45％的水分。试验证明：0.01％的胶原蛋白纯溶液就能形成很好的保水层，供给皮肤所需要的全部水分。胶原蛋白具有非常好的天然保湿功效，添加在化妆品中能有效锁住肌肤水分，维持肌肤水润状态
[0003]重组人源化胶原蛋白是基于人胶原蛋白的特征和主要功能序列重新优化设计并表达的具有人胶原蛋白特征的水溶性蛋白质，有良好的生物学相容性、细胞黏附性、促新细胞形成和止血功能，能迅速补充体内流失的胶原蛋白，促进皮肤细胞生长，修复断裂的纤维框架，修复皮肤屏障。因而重组胶原蛋白在医学领域，尤其是创面修复中极受欢迎，可制成胶原海绵、胶原膜、人工皮肤等。近几年涌现许多含重组胶原蛋白的疤痕修复产品，包括促进伤口愈合的水凝胶敷料、重组胶原蛋白医用水凝胶、重组人胶原蛋白可吸收水凝胶皮肤支架等。重组胶原蛋白修复凝胶能与皮肤完全融合，无任何排异或排斥现象，并能使创面及其周围皮肤保持一个湿润的环境，促进创面及周围皮肤的自我修复，以恢复正常状态起到屏障作用。
[0004]现有的重组人源化胶原蛋白，保湿效果，水溶性以及抗皱性较差，并且传统的制作工艺耗时多，不够效率，针对以上这些问题，在这里我们提出一种重组人源化胶原蛋白的制备方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术为解决上述技术不足，采用改性的技术方案，一种重组人源化胶原蛋白的制备方法，包括以下方法步骤，
[0006]S1，将毕赤酵母菌基因工程菌接种于种子罐中培养，待溶氧大幅度回升后转移至生产发酵罐；
[0007]S2，将生产发酵罐内的毕赤酵母菌基因工程菌培养至溶氧大幅度回升后，使用复合原料进行混合碳源补料；
[0008]S3，结束混合碳源补料后，使用发酵液进行补料并持续进行发酵处理，发酵过程中保持注入补料气体，保持300ml/min注入；
[0009]S4，使用缓冲液进行混合，然后进行提纯处理；
[0010]S5，对提纯后的原料进行消毒处理，即完成加工。
[0011]作为本专利技术的进一步优选方式，所述毕赤酵母菌基因工程制作方法如下，L1，先将
毕赤酵母菌种放入3
‰‑
10
‰
的培养基进行浸泡10
‑
20min，再把原料清洗至中性，培养得到一级种子；
[0012]L2，将一级种子液按照10％～16％的接种量接种于35L种子罐中的底料培养基中，培养得到二级种子；
[0013]L3，待二级种子液溶氧大幅度回升后，按照17％～18％的接种量接种于150L种子罐中的底料培养基中，培养得到三级种子，再将三级种子放入发酵罐中进行发酵处理，发酵过程中采用6
‑
8mol/L的碳酸氢钾溶液，调节发酵液的pH，使发酵过程pH 2
‑
6。
[0014]作为本专利技术的进一步优选方式，步骤S1中，按照物料比1:3(w/v)
‑
1:4(w/v)加入纯化水，90
‑
95℃灭菌20
‑
30min，冷却至30℃。
[0015]作为本专利技术的进一步优选方式，步骤S1中，初次发酵过程中，PH控制在6.0
‑
7.8，37
‑
42℃保温水解6
‑
7h，然后离心过滤，取过滤清液；使用截留分子量为6000的超滤设备进行超滤，并补加纯化水使超滤更加完全，取透出液。
[0016]作为本专利技术的进一步优选方式，步骤S3中，所述补料气体为氨气、氮气、氧气及二氧化碳构成的混合物，且混合比例为1:1.2:1.4:1.5。
[0017]作为本专利技术的进一步优选方式，步骤S4中，加入缓冲液重悬至120
‑
230g/L
→
悬浮物使用高压均质机裂解，离心收集裂解物上清，上清过滤去除不溶物杂质
→
上清中加入终浓度为80
‑
180mM硝酸镁，搅拌均匀后离心收集上清，PH调整至5.5
→
将pH处理后上清加入硝酸镁颗粒盐析至终浓度达到1.4
‑
1.6M，离心收集盐析沉淀
→
盐析沉淀使用纯化水溶解,1L水对1kg初始湿菌体,3h以上，离心收集上清并过滤除去颗粒或絮状杂质，将该上清放入到10
‑
25℃内维持6h以上，此时蛋白析出，低温离心收集沉淀即可获得粗品，再进行纯化。
[0018]作为本专利技术的进一步优选方式，步骤S2，所述复合原料为生理盐水、双氧水、碳酸铵构成的混合物。
[0019]作为本专利技术的进一步优选方式，所述培养基的成份为以下，葡萄糖1.5
‑
3.0份，蛋白胨1.0
‑
2.5份，酵母粉2.5
‑
4份，琼脂粉0.5
‑
2.0份，硫酸钾1.5
‑
4份、维生素C0.5
‑
1份、硫酸镁1
‑
3份。
[0020]本专利技术所达到的有益效果是：本专利技术大幅度减小了原料的用量，且促进了毕赤酵母菌体的生长，缩短了发酵周期，同时增加了重组人源化胶原蛋白的表达量，通过特殊的补料方式调节原料的代谢途径，有效减少重组人源化胶原蛋白的降解。
具体实施方式
[0021]下面将结合本专利技术实施例中，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0022]本专利技术提供一种技术方案：一种重组人源化胶原蛋白的制备方法，包括以下方法步骤，
[0023]S1，将毕赤酵母菌基因工程菌接种于种子罐中培养，待溶氧大幅度回升后转移至生产发酵罐；
[0024]S2，将生产发酵罐内的毕赤酵母菌基因工程菌培养至溶氧大幅度回升后，使用复
合原料进行混合碳源补料；
[0025]S3，结束混合碳源补料后，使用发酵液进行补料并持续进行发酵处理，发酵过程中保持注入补料气体，保持300ml/min注入；
[0026]S4，使用缓冲液进行混合，然后进行提纯处理；
[0027]S5，对提纯后的原料进行消毒处理，即完成加工。
[0028]所述毕赤酵母菌基因工程制作方法如下，L1，先将毕赤酵母菌种放入3
‰‑
10
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的培养基进行浸泡10
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于：包括以下方法步骤，S1，将毕赤酵母菌基因工程菌接种于种子罐中培养，待溶氧大幅度回升后转移至生产发酵罐；S2，将生产发酵罐内的毕赤酵母菌基因工程菌培养至溶氧大幅度回升后，使用复合原料进行混合碳源补料；S3，结束混合碳源补料后，使用发酵液进行补料并持续进行发酵处理，发酵过程中保持注入补料气体，保持300ml/min注入；S4，使用缓冲液进行混合，然后进行提纯处理；S5，对提纯后的原料进行消毒处理，即完成加工。2.根据权利要求1所述的一种重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述毕赤酵母菌基因工程制作方法如下，L1，先将毕赤酵母菌种放入3
‰‑
10
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的培养基进行浸泡10
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20min，再把原料清洗至中性，培养得到一级种子；L2，将一级种子液按照10％～16％的接种量接种于35L种子罐中的底料培养基中，培养得到二级种子；L3，待二级种子液溶氧大幅度回升后，按照17％～18％的接种量接种于150L种子罐中的底料培养基中，培养得到三级种子，再将三级种子放入发酵罐中进行发酵处理，发酵过程中采用6
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8mol/L的碳酸氢钾溶液，调节发酵液的pH，使发酵过程pH 2
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6。3.根据权利要求1所述的一种重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S1中，按照物料比1:3(w/v)
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1:4(w/v)加入纯化水，90
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95℃灭菌20
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30min，冷却至30℃。4.根据权利要求1所述的一种重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S1中，初次发酵过程中，PH控制在6.0
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7.8，37
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42℃保温水解6
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【专利技术属性】
技术研发人员：乔瑞龙，田培华，田之林，
申请(专利权)人：南京汇创星美生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：