一种三螺旋重组人源化Ⅱ型胶原蛋白、制备方法及应用技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及一种三螺旋重组人源化Ⅱ型胶原蛋白、制备方法及应用。本发明专利技术所述重组人源化Ⅱ型胶原蛋白具有三螺旋结构和(Gly

【技术实现步骤摘要】
一种三螺旋重组人源化Ⅱ型胶原蛋白、制备方法及应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种三螺旋重组人源化Ⅱ型胶原蛋白、制备方法及应用。

技术介绍

[0002]胶原蛋白是哺乳动物体内含量最高的蛋白质，约占蛋白质总量的30％。胶原蛋白具有特征性的三螺旋结构，并可以自组装形成良好形貌的胶原纤维。胶原纤维进一步组装形成纤维网格结构，为结缔组织提供机械强度，并为细胞生长提供适宜的环境。到目前为止，已发现至少40余种胶原蛋白链的编码基因。这些不同的胶原蛋白链，以不同的方式组合，可以形成20多种不同类型的胶原蛋白分子。其中，Ⅱ型胶原蛋白由3条相同的α1链组成，主要分布在软骨、玻璃体中，占人软骨基质胶原蛋白总量的90％以上。
[0003]Ⅱ型胶原蛋白为主要原料的生物材料在组织工程和再生医学等领域广泛应用。Ⅱ型胶原蛋白来源丰富，目前主要通过动物组织提取。已经开发酸、碱或蛋白酶等不同处理方法和工艺，从猪、牛、羊等动物的软骨中提取获得Ⅱ型胶原蛋白。然而，动物提取方法容易破坏胶原蛋白的三螺旋结构和生物活性，并存在病毒传播隐患等风险。通过基因工程技术制备的重组胶原蛋白可以克服动物源胶原蛋白的批次质量差异、病毒传染隐患等风险，因此逐渐成为研究热点。转基因植物、哺乳动物细胞等被用来生产重组胶原蛋白，但是转基因植物、哺乳动物细胞等表达体系生产成本高、周期长。
[0004]大肠杆菌表达系统具有成本低、表达量高等优点，因此被尝试用来制备重组Ⅱ型胶原蛋白。中国专利CN1380414A公开了一种重组人Ⅱ型胶原功能性多肽250
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270及其制备方法和用途，成功构建了含有人Ⅱ型胶原功能性多肽CⅡ250
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270多聚基因片段的重组质粒和表达质粒，并在大肠杆菌中表达目的多肽。上述专利制备的重组Ⅱ型胶原多肽，缺乏胶原蛋白特征性的三螺旋结构和纤维形貌。
[0005]针对上述技术问题，本专利技术提供了一种三螺旋重组人源化Ⅱ型胶原蛋白、制备方法及其应用。所述重组人源化Ⅱ型胶原蛋白具有胶原蛋白特征性的三螺旋结构，且100％严格遵守Gly
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X
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Y重复序列，并可自组装形成良好形貌的胶原纤维；所述重组人源化Ⅱ型胶原蛋白具有人Ⅱ型胶原蛋白重要的功能位点，表现出优异的生物相容性和生物活性，可以显著促进关节软骨细胞的增殖、黏附和迁移；所述重组人源化Ⅱ型胶原蛋白可广泛应用于人工骨、人工软骨、人工眼角膜、玻璃体、医疗器械、保健品等领域。

技术实现思路

[0006]针对上述技术问题，本专利技术的首要目的是提供了一种三螺旋重组人源化Ⅱ型胶原蛋白、制备方法及其应用，所述三螺旋重组人源化Ⅱ型胶原蛋白具有胶原蛋白特征的三螺旋结构，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述重组人源化Ⅱ型胶原蛋白具有三螺旋结构和(Gly
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X
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Y)n重复氨基酸序列，并可自组装形成良好形貌的胶原纤维；所述重组人源化Ⅱ型胶原蛋白具有人Ⅱ型胶原蛋白重要的功能位点，表现出良好的生物相容性和生物活性，
可以显著促进关节软骨细胞的增殖、粘附和迁移，可广泛应用于人工骨、人工软骨、人工眼角膜、玻璃体、医疗器械、保健品等领域；而且本专利技术通过基因工程菌表达制备重组人源化Ⅱ型胶原蛋白，工艺简单方便，易于实现工业化生产。具体包括以下内容：
[0007]第一方面，本专利技术提供了一种三螺旋重组人源化Ⅱ型胶原蛋白，所述三螺旋重组人源化Ⅱ型胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1。
[0008]第二方面，本专利技术提供了一种三螺旋重组人源化Ⅱ型胶原蛋白，所述重组人源化Ⅱ型胶原蛋白由蛋白酶处理前体胶原蛋白后获得；所述前体胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]优选地，所述前体胶原蛋白的基因序列如SEQ ID NO.3所示。
[0010]优选地，所述蛋白酶包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、凝血酶。
[0011]优选的，所述的蛋白酶为胰蛋白酶。
[0012]第三方面，本专利技术提供了一种携带上述第二方面中所述前体胶原蛋白基因的重组载体或重组基因工程菌。
[0013]优选地，所述载体包括pCold或pET。
[0014]优选地，所述工程菌为大肠杆菌。
[0015]第四方面，本专利技术提供了一种上述第一方面或第二方面所述三螺旋重组人源化Ⅱ型胶原蛋白的制备方法，所述方法为：
[0016](1)合成编码上述第二方面所述前体胶原蛋白的基因序列；
[0017](2)将步骤(1)所述基因序列与载体连接，转化细菌，构建重组基因工程菌；
[0018](3)表达步骤(2)构建的重组基因工程菌，收集菌体沉淀，破碎得上清液，纯化后获得前体胶原蛋白；
[0019](4)加入蛋白酶对步骤(3)获得的前体胶原蛋白进行处理，纯化后获得三螺旋重组人源化Ⅱ型胶原蛋白。
[0020]优选地，所述前体胶原蛋白的基因序列如SEQ ID NO.3所示。
[0021]优选地，所述蛋白酶包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、凝血酶。
[0022]优选的，所述的蛋白酶为胰蛋白酶。
[0023]优选地，所述步骤(2)中的载体包括pCold或pET。
[0024]优选地，所述步骤(2)中的细菌为大肠杆菌。
[0025]优选地，所述步骤(3)中纯化为亲和层析。
[0026]第五方面，本专利技术提供了一种上述第一方面或第二方面所述的三螺旋重组人源化Ⅱ型胶原蛋白在制备人工骨、人工软骨、人工眼角膜、玻璃体、医疗器械、保健品中的应用。
[0027]本专利技术的有益效果是：与现有技术相比，
①
本专利技术提供了一种三螺旋重组人源化Ⅱ型胶原蛋白，与动物来源的Ⅱ型胶原蛋白相比，具有无病毒传播隐患、低免疫原性等优点；
②
本专利技术提供的重组人源化Ⅱ型胶原蛋白具有胶原蛋白特征性的三螺旋结构以及(Gly
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X
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Y)n重复氨基酸序列；
③
本专利技术提供的三螺旋重组人源化Ⅱ型胶原蛋白可自组装形成形貌良好、与天然胶原蛋白类似的胶原纤维；
④
本专利技术提供的三螺旋重组人源化Ⅱ型胶原蛋白具有人Ⅱ型胶原蛋白重要的功能位点，生物相容性好、生物活性高，可以显著促进关节软骨细胞的增殖、黏附和迁移；
⑤
本专利技术提供的三螺旋重组人源化Ⅱ型胶原蛋白的基因工程菌表达体系，制备工艺简单方便，易于实现规模化生产；
⑥
本专利技术制备的高生物活性的
三螺旋重组人源化Ⅱ型胶原蛋白，可广泛应用于人工骨、人工软骨、人工眼角膜、玻璃体、医疗器械、保健品等领域。
附图说明
[0028]本专利技术的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解。
[0029]图1本专利技术所述三螺旋重组人源化Ⅱ型胶原蛋白的SDS
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PAGE鉴定图；
[0030]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种三螺旋重组人源化Ⅱ型胶原蛋白，其特征在于，所述三螺旋重组人源化Ⅱ型胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1。2.一种三螺旋重组人源化Ⅱ型胶原蛋白，其特征在于，所述重组人源化Ⅱ型胶原蛋白由蛋白酶处理前体胶原蛋白后获得；所述前体胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.如权利要求2所述三螺旋重组人源化Ⅱ型胶原蛋白，其特征在于，所述前体胶原蛋白的基因序列如SEQ ID NO.3所示。4.如权利要求2所述三螺旋重组人源化Ⅱ型胶原蛋白，其特征在于，所述蛋白酶包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、凝血酶。5.一种携带权利要求3所述基因的重组载体或重组基因工程菌。6.如权利要求5所述的重组载体或重组基因工程菌，其特征在于，所述载体包括pCold或pET。7.如权利要求5所述重组载体或重组基因工...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖建喜，位楠楠，
申请(专利权)人：胶原蛋白武汉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：