一种长效重组弹性蛋白、PEG化长效重组弹性蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种长效重组弹性蛋白、PEG化长效重组弹性蛋白及其制备方法和应用，所述长效重组弹性蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.1所示，PEG化长效重组弹性蛋白，通过对长效重组弹性蛋白进行PEG定点修饰得到，相对于长效重组弹性蛋白，PEG化长效重组弹性蛋白在不降低长效重组弹性蛋白活性的情况下，显著提升了长效重组弹性蛋白的热稳定性，本发明专利技术提供的PEG化长效重组弹性蛋白能够促进成纤维细胞产生胶原蛋白，这使得其在护肤品领域具有巨大的应用潜力，具有抗衰除皱、增加皮肤弹性的功效。具有抗衰除皱、增加皮肤弹性的功效。具有抗衰除皱、增加皮肤弹性的功效。

【技术实现步骤摘要】
一种长效重组弹性蛋白、PEG化长效重组弹性蛋白及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种长效重组弹性蛋白、PEG化长效重组弹性蛋白及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]弹性蛋白是细胞外基质分子中最稳定的蛋白质，主要由成纤维细胞、大动脉平滑肌细胞和弹性软骨的软骨细胞等产生，可与微原纤维结合形成弹性纤维，其主要功能是被动伸缩，给予组织和器官伸缩性和可逆的变形能力。弹性蛋白是一种巨大、复杂的、疏水性的蛋白，弹性蛋白不易被普通的蛋白酶降解，但能够被其它特殊的蛋白酶降解，如基质金属蛋白酶、组织蛋白酶等。弹性蛋白原通过化学方式降解，变成弹性蛋白多肽。
[0003]目前合成的弹性蛋白肽有8种，包括Kappa elastin，VGVAPG六肽序列、GPGVGVGVP和GLGVGAGVP九肽序列，PGAIPG，LRECDPS，α
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elastin和β
‑
elastin。弹性蛋白作为与胶原蛋白同样重要的结构蛋白，在生物医用材料领域显示其优势，其蛋白结构域特点为：富含非极性氨基酸，特别是甘氨酸、撷氨酸、脯氨酸和丙氨酸，由于原弹性蛋白的大分子性，对其原始序列直接进行异源表达困难。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种PEG化长效重组弹性蛋白，运用酿酒酵母表达长效重组弹性蛋白，其氨基酸组成是有天然弹性蛋白关键六肽重复序列VAPGIG和九肽重复序列GVGGLGVPG，所述PEG化长效重组弹性蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.2所示，具有与天然弹性蛋白相同的生物学活性。
[0005]编码所述PEG化长效重组弹性蛋白的基因的核苷酸序列是通过一段Linker将编码天然弹性蛋白中关键六肽重复序列VAPGIG的核苷酸和编码九肽重复序列GVGGLGVPG的核苷酸连接后进行人工设计得到的；编码所述PEG化长效重组弹性蛋白的基因的核苷酸序列如Seq ID NO.1所示。
[0006]编码所述PEG化长效重组弹性蛋白的基因的核苷酸序列包括Not I酶切位点、Xba I酶切位点、起始密码子、终止密码子及6
×
His标签序列。进一步地，Not I酶切位点的核苷酸序列为GCGGCCGC。
[0007]进一步地，Xba I酶切位点的核苷酸序列为TCTAGA。
[0008]进一步地，起始密码子的核苷酸序列为ATG。
[0009]进一步地，终止密码子的核苷酸序列为TAA。
[0010]进一步地，6
×
His标签序列为：CATCACCATCACCATCAC。
[0011]本专利技术还提供了一种PEG化长效重组弹性蛋白，通过将上述酿酒酵母表达的长效重组弹性蛋白进行PEG化修饰得到，具体是在其蛋白质C端的羧基上进行PEG修饰。
[0012]本专利技术还提供了所述PEG化长效重组弹性蛋白的制备方法，所述制备方法包括以
下步骤：
[0013]1)向含有所述长效重组弹性蛋白的MES缓冲液中加入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺(EDC)和胱胺，于4℃反应3小时；
[0014]2)然后向步骤1)中加入三(2
‑
氯乙基)磷酸酯(TCEP)，4℃反应2小时；
[0015]3)最后加入甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺，4℃反应20小时；
[0016]4)所得反应液纯化，即可得到所述PEG定点修饰长效重组弹性蛋白。
[0017]步骤1)中，MES缓冲液的pH为5.0～6.0，优选为5.5。
[0018]所述甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺(mPEG
‑
MAL)的分子量范围为1
‑
40KD，优选为8～12kD。mPEG
‑
MAL的形状为直链或分枝状，优选为分枝状。
[0019]所述长效重组弹性蛋白、1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺、胱胺的摩尔比为1：2：2。
[0020]所述长效重组弹性蛋白、甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺的摩尔比为1：4。
[0021]本专利技术还提供了所述PEG化长效重组弹性蛋白在护肤品中的应用，可以其作为任意类型护肤品中的活性成分，达到抗衰除皱、增加皮肤弹性的功效。
[0022]本专利技术运用基因工程技术对天然弹性蛋白中六肽重复序列与九肽重复序进行人工设计，两者用一段Linker连接成为(VAPGIG)
32
‑
Linker
‑
(GVGGLGVPG)
16
的类弹性蛋白(elastin
‑
like polypeptides,ELP)，运用酿酒酵母表达体系异源表达后获得长效重组弹性蛋白，但该长效重组弹性蛋白热稳定性差的弊端，在使用和产品推广中受到阻碍，因此可通过PEG修饰改造长效重组弹性蛋白，增强热稳定性，生物活性不受影响。
[0023]PEG是一种无毒性、无免疫原性、安全的聚合物。PEG与蛋白质进行共价偶联修饰。PEG修饰可通过优化pH等反应条件，对氨基酸N端、羧基端和巯基进行定点修饰。
[0024]本专利技术通过优化PEG与长效重组人弹性蛋白反应条件，将PEG定点修饰至长效重组弹性蛋白C端的羧基，不改变活性中心结合位点，增强其热稳定性实验。
[0025]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0026]根据本专利技术的再一方面，提供了PEG化长效重组弹性蛋白可促进细胞粘附活性测试，比活性达到2.03
±
0.12
×
104U/mg，与未修饰长效重组弹性蛋白活性比较无明显变化，长效重组弹性蛋白经过PEG修饰不改生物学活性。
[0027]在一些实施中，PEG化长效重组弹性蛋白放置55℃第4h、8h、12h、24h、3d、5d、15d和30d，进行加速破坏使用，经过测试其促进细胞粘附活性，放置第30d，其活性无明显变化，而长效重组人弹性蛋白放置第8h，活性就已丧失，长效重组弹性蛋白经过PEG修饰后对热有很好的稳定性。
[0028]在具体的实施中，PEG化长效重组弹性蛋白可促进BALB/C 3T3小鼠胚成纤维细胞产生胶原蛋白，经过0.1μg/mL、1μg/mL和10μg/mL的PEG
‑
重组人弹性蛋白作用成纤维细胞，胞体被天狼猩红苦味酸染成红色，将胞内天狼猩红苦味酸溶解后，在波长540nm处测试吸光值，0.1μg/mL、1μg/mL和10μg/mL的PEG
‑
长效重组弹性蛋白都可促进成纤维细胞产生胶原蛋白。
[0029]在一些实例中，受试女性在使用PEG化长效重组人弹性蛋白精华液时，使用第14d时皮肤弹性R2值与使用前比较差异不显著，而使用第28d时皮肤弹性R2值显著提高，差异显著。而使用第14d和28d时，鱼尾纹的皮肤皱纹面积与使用前比较明显本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种长效重组弹性蛋白，其特征在于，所述长效重组弹性蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.2所示。2.编码如权利要求1所述的长效重组弹性蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如Seq ID NO.1所示。3.含有如权利要求2所述的基因的表达载体。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为酿酒酵母。5.一种PEG化长效重组弹性蛋白，其特征在于，通过对如权利要求1所述的长效重组弹性蛋白进行PEG定点修饰得到。6.如权利要求5所述的PEG化长效重组弹性蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：1)向含有如权利要求1所述的长效重组弹性蛋白的MES缓冲液中加入1
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(3
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二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺和胱胺，于4℃反应3小时；2)然后向步骤1)中加入三(2
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【专利技术属性】
技术研发人员：赵俊，夏兵兵，李增，刘家炉，
申请(专利权)人：芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：