一种牦牛卵巢卵丘细胞系及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种牦牛卵巢卵丘细胞系及其构建方法和应用，属于动物细胞工程领域。上述构建方法是通过将外源病毒癌基因SV40

【技术实现步骤摘要】
一种牦牛卵巢卵丘细胞系及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及动物细胞工程领域，特别是涉及一种牦牛卵巢卵丘细胞系及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]细胞在体外培养增殖到一定阶段就会发生形态学上的改变，但通过导入外源基因(端粒酶和TERT)或病毒癌基因(SV40)的转化等方法可使细胞维持端粒长度，突破衰老继续增殖，进而实现永生化，与原代细胞相比，细胞系容易获得。近些年，随着越来越多细胞系的建立，细胞系被广泛应用于各类研究，但哺乳动物生殖相关细胞系的建立还存在一些难以攻克的问题。
[0003]就哺乳动物卵巢生殖细胞而言，第一个保留颗粒细胞部分分化功能的颗粒细胞系是学者Zeleznik等在1979年利用原代大鼠颗粒细胞，与SV40转化的失去产生孕酮能力的大鼠卵巢颗粒细胞系杂交建立的大鼠GC48C细胞系，但其在连续培养11个月后，失去了分泌类固醇激素的特性；随后学者Fitz等利用SV40转化法于1989年建立了第一个保留未成熟、非黄体化颗粒细胞特性的模型，DC3细胞系；1998年，学者Sugino等人通过感染温度敏感的猿病毒(SV
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40tsA209)突变体成功转化大鼠黄体细胞来开发了黄体细胞系GG
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CL。此后各种哺乳动物卵巢细胞系培养迅速发展，2012年，李伟等通过将hTERT基因转染至山羊黄体细胞中得到了保持原代黄体细胞相关特性的永生化山羊黄体细胞系；2015年，Liang Zhang等人也利用hTERT基因导入的方法建立了黄体分泌功能和激素受体表达正常永生化猪黄体细胞系。但到目前为止，成功建立的卵巢卵丘细胞系少之又少，也并未见能用于细胞生物学和分子生物学研究的成品牦牛卵丘细胞系。
[0004]牦牛是青藏高原及其毗邻地区的主要畜种，在漫长的进化过程中形成了独特的形态特征和生理机制，对当地农牧民的生产生活具有不可替代的作用。在自然放牧条件下，牦牛繁殖率为60％～75％，繁殖成活率仅为45％～75％，严重制约了牦牛产业的发展。采用现代繁殖技术提高母牦牛的繁殖潜力是牦牛产业高效发展的重要途径之一，但牦牛不仅繁殖力低，其体外卵母细胞成熟率和胚胎发育能力也都较为低下，严重影响其体细胞克隆和体外受精等繁殖技术的发展。
[0005]卵母细胞作为现代繁殖技术的基础材料，其质量影响着后续胚胎质量，而卵母细胞周围的卵丘细胞专门为卵母细胞的发育服务。众所周知，卵母细胞与其周围卵丘细胞之间的双向信号交流对于调节卵母细胞的减数分裂成熟和发育至关重要，卵丘细胞扩张是卵母细胞减数分裂恢复的必要条件。目前，对牦牛卵母细胞成熟的研究较少，成熟过程中的相关分子机理也还尚不明确。
[0006]因此，为进一步在分子和细胞水平上了解调节卵巢类固醇生成和卵泡生成的机制，有必要建立一种易于获得的细胞进行体外研究，开发一种构建方法来解决研究过程中的上述问题。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种牦牛卵巢卵丘细胞系及其构建方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本专利技术构建了一种易于培养，生长迅速的牦牛卵巢卵丘细胞系，该牦牛卵丘细胞系能在体外连续传代，并保留有原代细胞特性。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0009]本专利技术提供一种牦牛卵巢卵丘细胞系的建立方法，所述建立方法包括：通过将外源病毒癌基因SV40
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LT转至牦牛卵巢卵丘细胞，获取能体外连续传代，并保留原代卵丘细胞特性的牦牛卵巢卵丘细胞系。
[0010]外源病毒癌基因SV40
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LT(SEQ ID NO：1)：
[0011]gtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaggatctatttccggtgaattcatggataaagttttaaacagagaggaatctttgcagctaatggaccttctaggtcttgaaaggagtgcctgggggaatattcctctgatgagaaaggcatatttaaaaaaatgcaaggagtttcatcctgataaaggaggagatgaagaaaaaatgaagaaaatgaatactctgtacaagaaaatggaagatggagtaaaatatgctcatcaacctgactttggaggcttctgggatgcaactgagattccaacctatggaactgatgaatgggagcagtggtggaatgcctttaatgaggaaaacctgttttgctcagaagaaatgccatctagtgatgatgaggctactgctgactctcaacattctactcctccaaaaaagaagagaaaggtagaagaccccaaggactttccttcagaattgctaagttttttgagtcatgctgtgtttagtaatagaactcttgcttgctttgctatttacaccacaaaggaaaaagctgcactgctatacaagaaaattatggaaaaatattctgtaacctttataagtaggcataacagttataatcataacatactgttttttcttactccacacaggcatagagtgtctgctattaataactatgctcaaaaattgtgtacctttagctttttaatttgtaaaggggttaataaggaatatttgatgtatagtgccttgactagagatccattttctgttattgaggaaagtttgccaggtgggttaaaggagcatgattttaatccagaagaagcagaggaaactaaacaagtgtcctggaagcttgtaacagagtatgcaatggaaacaaaatgtgatgatgtgttgttattgcttgggatgtacttggaatttcagtacagttttgaaatgtgtttaaaatgtattaaaaaagaacagcccagccactataagtaccatgaaaagcattatgcaaatgctgctatatttgctgacagcaaaaaccaaaaaaccatatgccaacaggctgttgatactgttttagctaaaaagcgggttgatagcctacaattaactagagaacaaatgttaacaaacagatttaatgatcttttggataggatggatataatgtttggttctacaggctctgctgacatagaagaatggatggctggagttgcttggctacactgtttgttgcccaaaatggattcagtggtgtatgactttttaaaatgcatggtgtacaacattcctaaaaaaagatactggctgtttaaaggaccaattgatagtggtaaaactacattagcagctgctttgcttgaattatgtggggggaaagctttaaatgttaatttgcccttggacaggctgaactttgagc本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牦牛卵巢卵丘细胞系的建立方法，其特征在于，所述建立方法包括：通过将外源病毒癌基因SV40
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LT转至牦牛卵巢卵丘细胞，获取能体外连续传代，并保留原代卵丘细胞特性的牦牛卵巢卵丘细胞系。2.如权利要求1所述的牦牛卵巢卵丘细胞系的建立方法，其特征在于，所述建立方法具体包括以下步骤：(1)收集卵巢卵丘
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卵母细胞复合体，成熟培养后，消化、分离，去除卵母细胞，收集卵丘细胞；利用原代培养基培养所述卵丘细胞；(2)待步骤(1)中原代培养基培养的卵丘细胞长至80％
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90％后，消化，待细胞回缩变圆后终止消化，之后离心、重悬，再经传代培养，得到稳定传代的原代卵丘细胞；(3)将含有SV40
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LT基因的过表达载体转染至293T细胞中，收集SV40过表达慢病毒，用其感染原代卵丘细胞后，转入含胎牛血清的DMEM
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F12培养液继续培养，再经筛选、鉴定，得到阳性牦牛卵巢卵丘细胞系。3.如权利要求2所述的牦牛卵巢卵丘细胞系的建立方法，其特征在于，步骤(1)中，成熟培养所用的培养基包括如下浓度的组分：M199培养液+10％胎牛血清+50μg
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mL
‑1促黄体生成素+100μg
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mL
‑1促卵泡生成素+100μg
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mL
‑1雌二醇+100μg
·...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘阳阳，张瑞，余四九，王立斌，王萌，王靖雷，叶小琳，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：