敲除细胞中目标基因的方法技术

本发明专利技术涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种敲除细胞中目标基因的方法。本发明专利技术提供一种敲除细胞中目标基因的方法，包括：(1)利用基因编辑系统实现所述细胞中目标基因外显子发生双链断裂；(2)在所述目标基因外显子发生双链断裂的位点引入终止密码子，以便实现所述细胞中目标基因的敲除。本发明专利技术提供的方法能够在构建目标基因敲除细胞系的过程中降低细胞的不均一性，避免筛选标记基因在基因组的随机插入，减少脱靶细胞等不利影响，将对基因功能的研究起到积极的作用。研究起到积极的作用。

【技术实现步骤摘要】
敲除细胞中目标基因的方法


[0001]本专利技术涉及细胞工程
，具体涉及一种敲除细胞中目标基因的方法。

技术介绍

[0002]CRISPR
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Cas9是细菌形成的一种适应性免疫防御机制，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA，这一过程主要依赖成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR)及其相关蛋白9(CRISPR
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associated protein,Cas9)。使用CRISPR
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Cas9系统的基因组编辑是利用短向导RNA的碱基互补配对来特异性识别目标DNA，通过Cas9的两个核酸酶结构域切割靶DNA链，从而在目标序列上产生双链断裂，进一步依赖同源重组DNA双链修复(HDR)或者非同源末端连接(NHEJ)的修复机制对双链断裂的DNA进行修复，这一技术被广泛应用于精准靶向基因的敲入或敲除，其具有短周期、高效率、低成本和易操作等优点，但脱靶也是该技术的缺点之一。
[0003]在对目标基因的功能进行科学研究时，构建目标基因敲除的细胞系是重要的一部分工作。目前主要采用的CRISPR
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Cas9基因敲除方法主要是通过非同源末端连接来实现的，其不依赖于同源DNA序列，是通过DNA连接酶将双链断裂末端直接连接进行修复，在这个过程中随机的碱基插入或者缺失能够造成移码，导致阅读框改变，从而实现目的基因的敲除。但由于这一修复过程中插入或缺失碱基是随机和非精确的，所以CRISPR
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Cas9途径容易导致构建的同一细胞系的不同细胞的靶位点基因组序列不尽相同，这样就可能会使构建细胞系的生物学特性的均一性受到影响，从而导致实验结果的稳定性和重复性降低。而且在构建目标基因敲除的细胞系时，CRISPR
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Cas9系统的脱靶会导致细胞不同位置出现意想不到的碱基错误，从而影响细胞本身的生物学特性。已有研究显示，CRISPR
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Cas9系统对基因组引进错误的数量甚至可以达到数百个，其中包括基因组单核苷酸突变和基因组的非编码区域突变，普通测序可能无法发现很多重要的突变，而全基因组的测序过于耗时耗力，在日常的科研工作中是难以实现的。并且，为了方便获得成功敲除目标基因的细胞系时，往往需要在构建过程中引入筛选标记，这主要是通过病毒转染来实现的，而病毒的转染会导致筛选标记基因插入基因组位置的随机性，这样会造成细胞生物学特性的不确定性，也对实验结果的稳定性造成严重影响，从而对科学研究的推进和数据的准确性带来较大影响。
[0004]所以，开发一种能够在构建目标基因敲除细胞系的过程中降低细胞的不均一性、筛选标记基因的随机插入以及脱靶等不利影响的方法，将对基因功能的研究起到积极的作用。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提供一种更加精确的对细胞进行目标基因敲除的方法，能够在构建目标基因敲除细胞系的过程中降低细胞的不均一性，避免筛选标记基因的在基因组的随机插入，减少脱靶细胞等不利影响，将对基因功能的研究起到积极的作用。
[0006]为此，本专利技术第一方面提供一种敲除细胞中目标基因的方法。在本专利技术的一些实施方案中，所述方法包括：
[0007](1)利用基因编辑系统实现所述细胞中目标基因外显子发生双链断裂；
[0008](2)在所述目标基因外显子发生双链断裂的位点引入终止密码子，以便实现所述细胞中目标基因的敲除。
[0009]目前主要采用CRISPR
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Cas9基因敲除方法，该方法在双链断裂末端修复时，插入或缺失碱基是随机和非精确的，所以CRISPR
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Cas9途径容易导致构建的同一细胞系的不同细胞的靶位点基因组序列不尽相同，这样就可能会使构建细胞系的生物学特性的均一性受到影响，从而导致实验结果的稳定性和重复性降低。而且在构建目标基因敲除的细胞系时，CRISPR
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Cas9系统的脱靶会导致细胞不同位置出现意想不到的碱基错误，从而影响细胞本身的生物学特性。同时，通过慢病毒等整合型病毒导入筛选标记基因的方式，会导致其在靶细胞的基因组中随机插入，从而对细胞生物学特性造成不确定性等不利影响。专利技术人建立了一种基因敲除的新方法，通过利用基因编辑体系建立目的基因双链断裂，通过在细胞基因组断裂位置引入终止密码子，从而阻止了靶基因的表达，同时也可选择引入筛选标记基因。该方法能够在构建目标基因敲除细胞系的过程中降低细胞的不均一性，避免筛选标记基因的在基因组的随机插入，减少脱靶细胞等不利影响，将对基因功能的研究起到积极的作用。
[0010]在本专利技术的一些实施方案中，所述基因编辑系统包括选自CRISPR/Cas9系统、巨型核酸酶(Meganuclease)、锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)。
[0011]在本专利技术的一些优选的实施方案中，所述基因编辑系统为CRISPR/Cas9系统。
[0012]在本专利技术的一些实施方案中，步骤(1)中，所述细胞中目标基因外显子发生双链断裂是通过以下方法实现的：
[0013]1)以所述目标基因外显子为靶标设计sgRNA序列，获取含有sgRNA序列的CRISPR
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Cas9载体；
[0014]2)将所述CRISPR
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Cas9载体导入所述细胞，使得所述细胞中目标基因外显子发生双链断裂。
[0015]在本专利技术的一些实施方案中，步骤(2)中，通过同源重组将所述终止密码子引入所述目标基因外显子发生双链断裂的位点。
[0016]在本专利技术的一些实施方案中，步骤(2)中，所述目标基因外显子发生双链断裂的位点引入所述终止密码子通过以下方法实现：
[0017](a)制备供体载体，其中，所述供体载体中含有针对所述sgRNA序列识别位点的左、右同源臂序列，所述左同源臂序列或者右同源臂序列中含有终止密码子；
[0018](b)将所述供体载体导入所述含有CRISPR
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Cas9载体的细胞中，以便将所述终止密码子引入所述细胞中目标基因外显子发生双链断裂的位点。
[0019]在本专利技术的一些实施方案中，所述终止密码子为多个串联的终止密码子。
[0020]在本专利技术的一些实施方案中，所述方法进一步包括：
[0021]将所述CRISPR
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Cas9载体和所述供体载体同时导入所述细胞。
[0022]本专利技术第二方面提供一种敲除目标基因的细胞系的制备方法。在本专利技术的一些实施方案中，所述制备方法包括：
[0023](I)采用第一方面所述的方法，敲除原代细胞中目标基因，获得经基因敲除的原代细胞；
[0024](Ⅱ)对所述经基因敲除的原代细胞进行传代培养，以便获得敲除目标基因的细胞系。
[0025]本发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种敲除细胞中目标基因的方法，其特征在于，包括：(1)利用基因编辑系统实现所述细胞中目标基因外显子发生双链断裂；(2)在所述目标基因外显子发生双链断裂的位点引入终止密码子，以便实现所述细胞中目标基因的敲除。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因编辑系统包括选自CRISPR/Cas9系统、巨型核酸酶、锌指核酸酶、转录激活样效应因子核酸酶。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述细胞中目标基因外显子发生双链断裂是通过以下方法实现的：1)以所述目标基因外显子为靶标设计sgRNA序列，获取含有sgRNA序列的CRISPR
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Cas9载体；2)将所述CRISPR
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Cas9载体导入所述细胞，使得所述细胞中目标基因外显子发生双链断裂。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，通过同源重组将所述终止密码子引入所述目标基因外显子发生双链断裂的位点。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述目标基因外显子发生双链断裂的位...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾泉，裴雪涛，谢小燕，徐蕾，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：