基因编辑系统在构建CFTR基因突变的囊性纤维化模型猪核移植供体细胞中的应用技术方案

本发明专利技术公开了基因编辑系统在构建CFTR基因突变的囊性纤维化模型猪核移植供体细胞中的应用。本发明专利技术提供了SEQ ID NO：16所示CFTR

【技术实现步骤摘要】
基因编辑系统在构建CFTR基因突变的囊性纤维化模型猪核移植供体细胞中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体属于基因编辑
，更具体涉及基因编辑系统在构建CFTR基因突变的囊性纤维化模型猪核移植供体细胞中的应用。

技术介绍

[0002]囊性纤维化是一种侵犯多脏器的常染色体隐性遗传病，该疾病在亚洲人群中罕见,但在高加索人群中较为常见，新生儿中的发病率约为1/2500
‑
1/3500。囊性纤维化的主要表现为外分泌腺的功能紊乱、黏液腺增生、分泌液黏稠等。临床上常影响呼吸道，也有胰脏、肠道、肝脏、肾脏等器官损害。
[0003]囊性纤维化的主要致病基因为CFTR(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)基因，CFTR是受cAMP调节的阴离子通道，在气道、胰脏和其他组织上皮细胞的顶端表面表达。当CFTR缺失或活性降低的时候，氯离子和碳酸氢根离子运输也相应地减少，易诱发强烈的分泌物浓缩、阻塞，并最终导致器官损伤。目前，CFTR基因已知有超过2000种突变，其中有242种突变被证实可导致囊性纤维化。
[0004]研究囊性纤维化的发生发展机制及研发相应的药物均需要在动物模型的基础上进行，目前常用的动物模型为小鼠模型，然而小鼠不论从体型、器官大小、生理、病理等方面都与人相差巨大，不能真实地模拟人类正常的生理、病理状态。猪作为大动物，其体型大小和生理功能与人类近似，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面要求较低，是理想的人类疾病模型动物。
[0005]基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的基因编辑到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等编辑技术，其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。目前，基因编辑技术被越来越多地应用到动物模型的制作上。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供基因编辑系统在构建CFTR基因突变的囊性纤维化模型猪核移植供体细胞中的应用。
[0007]本专利技术提供了CFTR
‑
gRNA1、CFTR
‑
gRNA3和NCN蛋白在制备试剂盒中的应用。
[0008]本专利技术还提供了CFTR
‑
gRNA1、CFTR
‑
gRNA3和PRONCN蛋白在制备试剂盒中的应用。
[0009]本专利技术还提供了CFTR
‑
gRNA1、CFTR
‑
gRNA3和特异质粒在制备试剂盒中的应用。
[0010]本专利技术提供了一种试剂盒，包括CFTR
‑
gRNA1、CFTR
‑
gRNA3和NCN蛋白。
[0011]本专利技术还提供了一种试剂盒，包括CFTR
‑
gRNA1、CFTR
‑
gRNA3和PRONCN蛋白。
[0012]本专利技术还提供了一种试剂盒，包括CFTR
‑
gRNA1、CFTR
‑
gRNA3和特异质粒。
[0013]以上任一所述试剂盒还包括猪细胞。
[0014]以上任一所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组猪细胞；(b)制备囊性纤维化模型猪；(c)制备囊性纤维化细胞模型或囊性纤维化组织模型或囊性纤维化器
官模型。
[0015]本专利技术提供了一种制备重组猪细胞的方法，包括如下步骤：将CFTR
‑
gRNA1、CFTR
‑
gRNA3和NCN蛋白共转染猪细胞，得到重组猪细胞。
[0016]所述共转染具体采用电击转染的方式。
[0017]电击转染的参数设置具体可为：1450V、10ms、3pulse。
[0018]所述共转染具体可采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪。
[0019]CFTR
‑
gRNA1、CFTR
‑
gRNA3和NCN蛋白的配比依次为：0.8
‑
1.2μg CFTR
‑
gRNA1：0.8
‑
1.2μg CFTR
‑
gRNA3：3
‑
5μg NCN蛋白。
[0020]CFTR
‑
gRNA1、CFTR
‑
gRNA3和NCN蛋白的配比依次为：1μg CFTR
‑
gRNA1：1μg CFTR
‑
gRNA3：4μg NCN蛋白。
[0021]猪细胞、CFTR
‑
gRNA1、CFTR
‑
gRNA3和NCN蛋白的配比依次为：10万个猪细胞：0.8
‑
1.2μg CFTR
‑
gRNA1：0.8
‑
1.2μg CFTR
‑
gRNA3：3
‑
5μg NCN蛋白。
[0022]猪细胞、CFTR
‑
gRNA1、CFTR
‑
gRNA3和NCN蛋白的配比依次为：10万个猪细胞：1μgCFTR
‑
gRNA1：1μg CFTR
‑
gRNA3：4μg NCN蛋白。
[0023]以上任一所述CFTR
‑
gRNA1为sgRNA，其靶序列结合区如SEQ ID NO：16中第3
‑
22位核苷酸所示。
[0024]具体的，所述CFTR
‑
gRNA1如SEQ ID NO：16所示。
[0025]具体的，所述CFTR
‑
gRNA1如SEQ ID NO：10所示。
[0026]以上任一所述CFTR
‑
gRNA3为sgRNA，其靶序列结合区如SEQ ID NO：17中第3
‑
22位核苷酸所示。
[0027]具体的，所述CFTR
‑
gRNA3如SEQ ID NO：17所示。
[0028]具体的，所述CFTR
‑
gRNA3如SEQ ID NO：12所示。
[0029]以上任一所述NCN蛋白为Cas9蛋白或具有Cas9蛋白的融合蛋白。
[0030]具体的，所述NCN蛋白如SEQ ID NO：3所示。
[0031]以上任一所述猪细胞为猪成纤维细胞。
[0032]以上任一所述猪细胞为猪原代成纤维细胞。
[0033]以上任一所述猪细胞为获自初生猪的猪原代成纤维细胞。
[0034]所述NCN蛋白的制备方法包括如下步骤：
[0035](1)将质粒pKG
‑
GE4导入大肠杆菌BL21(DE3)，得本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.CFTR
‑
gRNA1、CFTR
‑
gRNA3和NCN蛋白在制备试剂盒中的应用；所述CFTR
‑
gRNA1为sgRNA，其靶序列结合区如SEQ ID NO：16中第3
‑
22位核苷酸所示；所述CFTR
‑
gRNA3为sgRNA，其靶序列结合区如SEQ ID NO：17中第3
‑
22位核苷酸所示；所述NCN蛋白为Cas9蛋白或具有Cas9蛋白的融合蛋白；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组猪细胞；(b)制备囊性纤维化模型猪；(c)制备囊性纤维化细胞模型或囊性纤维化组织模型或囊性纤维化器官模型。2.CFTR
‑
gRNA1、CFTR
‑
gRNA3和PRONCN蛋白在制备试剂盒中的应用；CFTR
‑
gRNA1为权利要求1中所述的CFTR
‑
gRNA1；CFTR
‑
gRNA3为权利要求1中所述的CFTR
‑
gRNA3；所述PRONCN蛋白自上游至下游依次包括如下元件：信号肽、分子伴侣蛋白、蛋白标签、蛋白酶酶切位点、核定位信号、Cas9蛋白、核定位信号；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组猪细胞；(b)制备囊性纤维化模型猪；(c)制备囊性纤维化细胞模型或囊性纤维化组织模型或囊性纤维化器官模型。3.CFTR
‑
gRNA1、CFTR
‑
gRNA3和特异质粒在制备试剂盒中的应用；CFTR
‑
gRNA1为权利要求1中所述的CFTR
‑
gRNA1；CFTR
‑
gRNA3为权利要求1中所述的CFTR
‑
gRNA3；所述特异质粒自上游至下游依次包括如下元件：启动子、操纵子、核糖体结合位点、PRONCN蛋白的编码基因、终止子；所述PRONCN蛋白自上游至下游依次包括如下元件：信号肽、分子伴侣蛋白、蛋白标签、蛋白酶酶切位点、核定位信号、Cas9蛋白、核定位信号；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组猪细胞；(b)制备囊性纤维化模型猪；(c)制备囊性纤维化细胞模型或囊性纤维化组织模型或囊性纤维化器官模型。4.一种试剂盒，包括CFTR
‑
gRNA1、CFTR
‑
gRNA3和NCN蛋白；CFTR
‑
gRNA1为权利要求1中所述的CFTR
‑
gRNA1；CFTR
‑
gRNA3为权利要求1中所述的CFTR
‑
gRNA3；NCN蛋白为权利要求1中所述的NCN蛋白；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组猪细胞；(b)制备囊性纤维化模型猪；(c)制备囊性纤维化细胞模型或囊性纤维化组织模型或囊性纤维化器官模型。5.一种试剂盒，包括CFTR
‑
gRNA1、CFTR
‑
gRNA3和PRONCN蛋白；CFTR
‑
gRNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛冬，汪滔，马翔，王磊，程锐，方园，赵泽英，胡世芳，
申请(专利权)人：南京启真基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：