一种CHO细胞株、D-二聚体单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术属于医学检验体外诊断技术领域，公开了一种CHO细胞株、D

【技术实现步骤摘要】
一种CHO细胞株、D
‑
二聚体单克隆抗体及其应用


[0001]本专利技术属于医学检验体外诊断
，特别涉及CHO细胞株、D
‑
二聚体（D
‑
Dimer）单克隆抗体及其应用。

技术介绍

[0002]D
‑
Dimer是血液中的纤维蛋白单体在活化后的凝血因子XIII作用下相互交联成稳定的纤维蛋白聚合体后，再经纤溶酶水解所产生的一种特异性降解产物，是特异性的纤溶过程标记物。临床上D
‑
Dimer的水平升高常见于纤溶系统激活或亢进，如深静脉血栓（DVT）、肺动脉栓塞（PE）和弥散性血管内凝血（DIC）等。在正常妊娠后期，由于生理性高凝，D
‑
Dimer水平也会升高，但异常高的D
‑
Dimer水平多提示并发症。D
‑
Dimer阴性结果对疑似血栓性疾病有很高的阴性预测价值，从而可以减少有创的检查，避免盲目的抗凝治疗。目前D
‑
Dimer水平检测在灵敏度和检测限方面效果还不够理想。
[0003]免疫比浊法是抗原抗体结合动态测定方法。相比于传统ELISA法,免疫比浊法具有灵敏度高、线性范围更大、高通量、自动化程度高、简便快速等特点，适合大批量标本的检测。因此本领域迫切需要一种能够应用于免疫比浊法的准确度高、检测范围大的D
‑
Dimer体外诊断试剂盒，而试剂盒创新性研发的核心在于抗体的制备。

技术实现思路

[0004]本专利技术针对传统应用于免疫比浊法的抗体缺乏的问题，提供了一种CHO细胞株、D
‑
二聚体单克隆抗体及其应用。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术是采用下述的技术方案实现的：一种CHO细胞株，其命名为中国仓鼠卵巢细胞CHO DD，保藏于中国典型培养物保藏中心，所述CHO细胞株的保藏编号为CCTCC NO:C202202，保藏日期为2022年01月12日，保藏地址为：中国 武汉 武汉大学。其稳定表达D
‑
Dimer单克隆抗体。
[0006]本专利技术还提供了D
‑
Dimer单克隆抗体A包括如SEQ ID NO:7所示的轻链氨基酸序列和如SEQ ID NO:9所示的重链氨基酸序列。
[0007]本专利技术CHO细胞株分泌产生的D
‑
Dimer单克隆抗体在免疫比浊体外诊断试剂盒中的应用。
[0008]该试剂盒包括R1试剂和R2试剂，R2试剂中包含D
‑
Dimer单克隆抗体乳胶、牛血清白蛋白和ProClin 300，R1试剂包括3
‑
双（2
‑
羟乙基）氨基
‑2‑
羟基丙磺酸（DIPSO）缓冲液、氯化钠，、曲拉通X
‑
100和ProClin 300。
[0009]本专利技术同时提供了CHO细胞株的制备方法，包括以下步骤：步骤1：用完全弗氏佐剂和天然抗原对小鼠进行免疫，分离小鼠的脾脏细胞，使其在PEG融合剂作用下与SP2/0细胞融合，在HAT选择培养基上进行筛选，获得杂交瘤细胞；步骤2：提取杂交瘤细胞系的RNA，RT
‑
PCR扩增抗体轻链和重链可变区DNA的序列，对扩增后的DNA序列进行测序；
步骤3：将测序获得的轻链可变区DNA序列加上小鼠抗体IgK保守区的DNA序列，测序获得的重链可变区DNA序列加上小鼠抗体IgG1保守区DNA序列；步骤4：利用基因工程技术构建抗体轻链和重链表达载体；将载体转染进入CHO细胞系，获得稳定表达单克隆抗体的CHO细胞株。
[0010]进一步的，步骤3中，轻链混合引物：5
’‑
ACAGT TGGTG CAGCA TCTGC
‑3’
（IgK保守区5
’
端反向引物）5
’‑
GGCGA AGACT TGGGC TGGCC
‑3’
（IgL1保守区5
’
端反向引物）5
’‑
GGAGT GGACT TGGGC TGACC
‑3’
（IgL2保守区5
’
端反向引物）重链混合引物：5
’‑
CTAGG GGGTG TCGTT TTAGC
‑3’ꢀ
（IgG1 保守区5
’
端反向引物）5
’‑
GATGG GGCTG TTGTT TTAGC
‑3’ꢀ
（IgG2a 保守区5
’
端反向引物）5
’‑
GATGG GGGTG TTGTT TTAGC
‑3’ꢀ
（IgG2b 保守区5
’
端反向引物）5
’‑
GATGG GGCTG TTGTT GTAGC
‑3’ꢀ
（IgG3 保守区5
’
端反向引物）进一步的，所述步骤1中，与骨髓瘤细胞的融合的脾脏细胞为末次免疫后第三天取脾制成的细胞悬，其骨髓瘤细胞的混合比例为1：6到1：10。
[0011]进一步的，所述试剂盒包括R1试剂和R2试剂，R2试剂中包含D
‑
Dimer单克隆抗体乳胶、牛血清白蛋白和ProClin 300。
[0012]进一步的，R1试剂包括3
‑
双（2
‑
羟乙基）氨基
‑2‑
羟基丙磺酸（DIPSO）缓冲液、氯化钠，、曲拉通X
‑
100和ProClin 300。
[0013]与现有技术相比，本专利技术的有益之处为：本专利技术提供的抗体具有良好的特异性、线性范围宽、重复性好，与标准诊断方法西门子试剂盒的检测水准相一致，适合免疫比浊法测定D
‑
Dimer，并推广使用。
附图说明
[0014]下面结合附图对本专利技术作进一步的说明。
[0015]附图1为本专利技术ELISA检测D
‑
Dimer mAb3与纤维蛋白交叉反应曲线图。
具体实施方式
[0016]为了能够更清楚地理解本专利技术目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0017]在下面的描述中阐述了具体细节以便于充分理解本专利技术，但是本专利技术还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本专利技术并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。
[0018]实施例1一种CHO细胞株，其命名为中国仓鼠卵巢细胞CHO DD，保藏于中国典型培养物保藏中心，所述CHO细胞株的保藏编号为CCTCC NO:C202202，保藏日期为2022年01月12日，保藏地址为：中国 武汉 武汉大学。其稳定表达D
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Dimer单克隆抗体。
[0019]D
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Dimer单克隆抗体A包括如SEQ 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CHO细胞株，其特征在于，所述CHO细胞株的保藏编号为CCTCC NO:C202202，其稳定表达D
‑
Dimer单克隆抗体。2.权利要求1所述CHO细胞株分泌产生的D
‑
Dimer单克隆抗体，其特征在于，所述D
‑
Dimer单克隆抗体A包括如SEQ ID NO:7所示的轻链氨基酸序列和如SEQ ID NO:9所示的重链氨基酸序列。3.根据权利要求2所述的CHO细胞株分泌产生的D
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Dimer单克隆抗体在免疫比浊体外诊断试剂盒中的应用。4.根据权利要求1所述的CHO细胞株的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1：用完全弗氏佐剂和天然抗原对小鼠进行免疫，分离小鼠的脾脏细胞，使其在PEG融合剂作用下与SP2/0细胞融合，在HAT选择培养基上进行筛选，获得杂交瘤细胞；步骤2：提取杂交瘤细胞系的RNA，RT
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PCR扩增抗体轻链和重链可变区DNA的序列，对扩增后的DNA序列进行测序；步骤3：将测序获得的轻链可变区DNA序列加上小鼠抗体IgK保守区的DNA序列，测序获得的重链可变区DNA序列加上小鼠抗体IgG1保守区DNA序列；步骤4：利用基因工程技术构建抗体轻链和重链表达载体；将载体转染进入CHO细胞系，获得稳定表达单克隆抗体的CHO细胞株。5.据权利要求4所述的CHO细胞株的制备方法，其特征在于，步骤3中，轻链混合引物：5
’‑
ACAGT TGGTG CAGCA TCTGC
‑3’
（IgK保守区5
’
端反向引物）5
’‑
GGCGA AGACT TGGGC TGGCC
‑3’
（IgL1保守区5
’
端反向引物）5
’‑
GGAGT GGACT TGGGC TG...

【专利技术属性】
技术研发人员：王传新，杜鲁涛，王醒，李培龙，赵志敏，李娟，
申请(专利权)人：山东艾科达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：