嵌合抗原受体NK细胞、制备方法及其用途技术

本发明专利技术涉及新型嵌合抗原受体NK细胞、制备方法及其用途，其中包括对CAR结构的设计和调控CAR

【技术实现步骤摘要】
嵌合抗原受体NK细胞、制备方法及其用途


[0001]本专利技术涉及医学免疫学
，更具体地说，它涉及嵌合抗原受体NK细胞、制备方法及其用途。

技术介绍

[0002]自然杀伤细胞(NK细胞)是机体重要的免疫细胞，与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节等多种过程有关，是与B、T细胞并列的第三类淋巴细胞。NK细胞对靶细胞的杀伤依靠NK细胞表面的多种受体，其分为激活性受体(KAR)和抑制性受体(KIR)。正常细胞的主要组织相容性复合体(MHC)可结合KIR，抑制NK细胞活性，避免误伤。但异己细胞和有害细胞的MHC会出现丢失或者不匹配，无法抑制NK细胞活性而成为了靶标。还有一部分异己细胞和有害细胞会大量表达KAR配体，直接激活了NK细胞的杀伤。NK细胞激活后产生2种免疫应答：与靶细胞特异性结合，释放穿孔素和颗粒酶，直接杀伤靶细胞；以及释放淋巴因子，增强免疫效应。
[0003]嵌合抗原受体NK细胞(CAR
‑
NK细胞)指的是人工导入了CAR结构的NK细胞。CAR的结构包括抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、胞内结构域，其能特异性识别靶细胞抗原，直接激活NK细胞并杀伤靶细胞。CAR的靶向目标由人工设计决定，因此CAR
‑
NK细胞有精准定位并杀伤任何预期靶细胞的潜力(如图1)。
[0004]但来源于原代NK细胞的CAR
‑
NK细胞在体内的存活时间和增殖能力有限，因此需要较多的注射数量和注射次数。这增加了CAR
‑
NK细胞的制备成本，同时也增加了个体差异导致的治疗过程的不确定性。来源于NK细胞系的CAR
‑
NK细胞尽管可无限增殖，降低了制备成本，但其杀伤能力较低；并且其在体内的无限增殖将带来安全隐患。因此，存在对增强CAR
‑
NK细胞存活时间、增殖能力以及降低安全隐患的方法的需要。
[0005]多种组织或者器官受到损伤以及发生病变时，内部的成纤维细胞、周细胞等被激活，分化为肌成纤维细胞，引起组织大量纤维化，是射血分数保留心力衰竭(HFpEF)、射血分数中间范围型心力衰竭(HFmrEF)、射血分数降低心力衰竭(HFrEF)、特发性肺纤维化、肝硬化、和肾病等疾病的重要发病因素。成纤维细胞活化蛋白(FAP)和内皮唾液酸蛋白(CD248)是肌成纤维细胞的特异性标志物，仅在肌成纤维细胞中大量表达，不表达或很低表达于机体其他正常细胞中。因此，靶向FAP或者CD248的CAR
‑
NK细胞具有特异性杀伤肌成纤维细胞，减少甚至清除组织纤维化，从而治疗HFpEF、HFmrEF、HFrEF、特发性肺纤维化、肝硬化、和肾病的潜力。
[0006]人体中细胞的衰老将逐渐导致机体的衰老。衰老的细胞将特异性高表达尿激酶纤溶酶原激活剂受体(uPAR)。因此，靶向uPAR的CAR
‑
NK细胞具有特异性杀伤衰老化细胞，延缓机体衰老过程的潜力，并有改善特发性肺纤维化、肝纤维化、动脉粥样硬化、糖尿病、骨关节炎等衰老相关并发症的潜力。

技术实现思路

[0007]针对现有技术存在的不足，本专利技术在于提供嵌合抗原受体NK细胞、制备方法及其
用途。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：
[0009]一方面，本专利技术提供了嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，包括向NK细胞导入用于编码CAR的核酸和调控CAR
‑
NK细胞基因表达的核酸；所述调控CAR
‑
NK细胞基因表达包括上调内源基因表达、下调内源基因表达和加入自杀基因；所述CAR的结构包括抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、胞内结构域，所述抗原结合结构域特异性识别并结合靶细胞上的抗原，激活胞内结构域。CAR
‑
NK细胞可减少纤维化，从而治疗射血分数保留心力衰竭(HFpEF)、射血分数中间范围型心力衰竭(HFmrEF)、射血分数降低心力衰竭(HFrEF)、特发性肺纤维化、肝硬化、和肾病，或杀伤衰老化细胞，延缓机体衰老。
[0010]作为优选，所述抗原结合结构域包括：单链抗体(scFv)。CAR的抗原结合结构域由FAP、CD248、uPAR中的一种的scFv构成，可特异性识别并结合表达相应抗原的靶细胞。所述单链抗体的类型基于所述靶细胞上抗原的种类和数量确定；所述单链抗体特异性结合所述靶细胞的影响因素包括：铰链结构域的类型和长度。
[0011]作为优选，所述铰链结构域用于连接单链抗体和跨膜结构域，其包括CD8和CD28。
[0012]作为优选，所述跨膜结构域用于穿过细胞膜，将所述CAR锚定在细胞膜上，其包括CD8、CD28、NKG2D、程序化膜蛋白(proMP)。其中，proMP可减小CAR
‑
T细胞副作用。
[0013]作为优选，所述胞内结构域用于传递并放大单链抗体的激活信号，从而激活NK细胞并杀伤靶细胞，其包括共刺激域和信号传导域。
[0014]作为优选，所述共刺激域包括：CD28、肿瘤坏死因子受体超家族成员9重组蛋白(4
‑
1BB)、2B4。其中，CD28能带来短期、强效的杀伤能力；而4
‑
1BB能带来持久的杀伤能力。
[0015]作为优选，所述信号传导域包括CD3 zeta。
[0016]另一方面，本专利技术还提供了嵌合抗原受体NK细胞的制备方法，包括如下步骤：提取NK细胞；将编码CAR的核酸导入NK细胞获得CAR
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NK细胞；对所述CAR
‑
NK细胞基因表达进行调控。通过调控CAR
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NK细胞基因表达，可增强CAR
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NK细胞的存活时间、增殖和杀伤能力，并降低CAR
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NK细胞安全隐患。
[0017]作为优选，提取NK细胞包括：获取原代NK细胞或NK细胞系；或者，所述获取NK细胞系包括：使用NK
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92、NK
‑
92MI等细胞系，使用相应培养基扩增。NK细胞来源于外周血、脐带血或者NK
‑
92、NK92MI等细胞系。
[0018]作为优选，所述获取原代NK细胞包括：从外周血或脐带血中提取淋巴细胞，使用CD56磁珠分选出NK细胞，使用含白细胞介素2(IL2)的培养基扩增NK细胞。
[0019]作为优选，所述编码CAR的核酸的导入包括：使用含CAR核酸序列的慢病毒或逆转录病毒转染所述NK细胞，以得到CAR
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NK细胞。使用慢病毒或逆转录病毒转染，将能够编码IL15、IL7、CCR2、Bcl
‑
2、MCL1、CD16、HSV
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TK、iCasp9、利妥昔单抗结合表位的核酸导入CAR
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NK细胞，实现相应基因的上调以及插入。
[0020]作为优选，对所述CAR
‑
NK细胞的基因表达进行调控包括：上调内源基因表达、加入自杀基因和下本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，包括向NK细胞导入用于编码CAR的核酸和调控CAR
‑
NK细胞基因表达的核酸；所述调控CAR
‑
NK细胞基因表达包括上调内源基因表达、下调内源基因表达和加入自杀基因；所述CAR的结构包括抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、胞内结构域，所述抗原结合结构域特异性识别并结合靶细胞上的抗原，激活胞内结构域。2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，所述抗原结合结构域包括：scFv。3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，所述铰链结构域用于连接单链抗体和跨膜结构域，其包括CD8和CD28。4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，所述跨膜结构域用于穿过细胞膜，将所述CAR锚定在细胞膜上，其包括CD8、CD28、NKG2D、proMP。5.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，所述胞内结构域用于传递并放大单链抗体的激活信号，从而激活NK细胞并杀伤靶细胞，其包括共刺激域和信号传导域。6.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，所述共刺激域包括：CD28、4
‑
1BB、2B4。7.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，所述信号传导域包括CD3 zeta。8.权利要求1～7任一项所述的嵌合抗原受体NK细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：提取NK细胞；将编码CAR的核酸导入NK细胞获得CAR
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NK细胞；对所述CAR
‑
NK细胞基因表达进行调控。9.根据权利要求8所述的嵌合抗原受体NK细胞的制备方法，其特征在于，提取NK细胞包括：获取原代NK细胞或NK细胞系。10.根据权利要求9所述的嵌合抗原受体NK细胞的制备方法，其特征在于，所述获取原代NK细胞包括：从外周血或脐带血中提取淋巴细胞，使用CD56磁珠分选出NK细胞，使用含白细胞介素2(IL2)的培养基扩增NK细胞；或者，所述获取NK细胞系包括：使用NK
‑
92、NK
‑
92MI等细胞系，使用相应培养基扩增。...

【专利技术属性】
技术研发人员：霍云龙，首健，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：