【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学技术和酶工程，特别涉及一种多功能催化酶、多核苷酸、重组表达载体、宿主细胞、其制备方法以及其应用。本专利技术尤其涉及一种喹啉酸磷酸核糖转移酶，优选来源于吡啶霉素链霉菌(streptomyces pyridomyceticus)b-2517的喹啉酸磷酸核糖转移酶pyrz及其突变体的基因，并提供了该酶的异源表达载体构建方法及其重组突变体的构建方法。
技术介绍
1、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，nad)是一种与生命活动紧密相关的重要辅因子，在生物体内参与dna修复、转录表达、细胞周期调控、物质能量代谢等多种生命过程，包括糖酵解、三羧酸循环、脂肪酸氧化、氧化磷酸化等。nad+也是非氧化还原nad+依赖酶如长寿因子去乙酰化酶(sirtuins)和多腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly(ado-ribose)polymerase)等的共底物，有效协调代谢和衰老。
2、nad+具有重要的生物学意义，不同生物体中nad+的生物合成途径也被广泛研究。nad+形成主要通过两种生物合成途径，一是以天冬氨酸或色氨酸为起始单元的从头合成途径(de novo pathway)，二是以nad+降解产物为起始单元的补救途径(salvage pathway)。由于nad+分子较大无法被人体直接吸收利用，因此摄入生物合成途径中的中间体如烟酰胺单核苷酸nmn、烟酰胺(nam)和烟酰胺核糖(nr)等，进入人体后转化合成nad+是补充nad+的可行策略。其中，以nmn为补充前体，不仅
3、nmn的化学法制备方法有多种，但存在特异性不高、分离纯化困难、总体收率低、环境不友好等不利因素。基于生物途径设计的全酶催化法制备nmn具有专一、高效和绿色的特性，如以d-核糖和nam为起始原料，在核糖激酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶作用下得到nmn。因此，基于生物合成途径开发功能酶元件用于设计简洁、高效的酶催化新路径，是合成nmn的绿色有效策略。
4、喹啉酸qa是nad+从头合成途径的第一个重要中间体。喹啉酸磷酸核糖转移酶(qaprtase)是磷酸核糖转移酶家族蛋白，通常特异性识别底物喹啉酸，负责催化qa进入nad+合成途径的第一步反应，但该酶催化的反应是一个可逆反应，通常转化率在50％左右，导致效率不高，经济性不好。
5、因此，本领域中仍然需要开发新的具有喹啉酸磷酸核糖转移功能的催化酶，优选具有改善的催化转化效率的酶以及相关技术。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术提供一种新的多功能催化酶，尤其是具有喹啉酸磷酸核糖转移功能的催化酶。本专利技术还提供编码多功能催化酶的多核苷酸、重组载体、宿主细胞、制备多功能催化酶的方法、多功能催化酶或者多核苷酸或者根据重组表达载体在催化磷酸核糖转移、磷酸水解和核糖水解反应中任意一者中的应用以及利用多功能催化酶制备烟酰胺单核苷酸的方法。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了一种
3、1、一种多功能催化酶，包含与序列表中seq id no:2具有75％以上同一性的氨基酸序列。
4、2、如1所述的多功能催化酶，其中所述氨基酸序列与序列表中seq id no:2具有80％以上，优选90％以上的同一性。
5、3、如1或2所述的多功能催化酶，其中所述氨基酸序列为序列表中seq id no:2所示的氨基酸序列。
6、4.如1或2所述的多功能催化酶，其中以序列表中seq id no:2为参考序列，该氨基酸序列具有位于第296位的定点突变。
7、5.如4所述的多功能催化酶，其中序列表中seq id no.2中第296位的天冬氨酸被修饰为下列中的至少一种氨基酸：谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸以及赖氨酸，优选谷氨酸。
8、6.如4到5中任意一项所述的多功能催化酶，其中所述氨基酸序列为序列表中seqid no:4所示的氨基酸序列。
9、7.如以上1到6中任意一项所述的多功能催化酶，其中所述多功能催化酶衍生自吡啶霉素链霉菌(streptomyces pyridomyceticus)b-2517。
10、8.一种多核苷酸，其特征在于包含选自下列(i)和(ii)中任意一者的核苷酸序列：
11、(i)编码以上1到7中任一项所述的多功能催化酶的核苷酸序列；以及
12、(ii)与(i)中的核苷酸序列杂交并且具有喹啉酸磷酸核糖转移酶功能的核苷酸序列。
13、9、如8所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列与序列表中seq id no:1具有80％以上，优选90％以上的同一性。
14、10、如8或9所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列为序列表中seq id no:1所示的核苷酸序列。
15、11.如8或9所述的多核苷酸，其中以序列表中seq id no:1为参考序列，该核苷酸序列具有位于第886-888位的定点突变。
16、12.如11所述的多核苷酸，其中以序列表中seq id no:1为参考序列，该核苷酸序列在第886-888位被替换为aat。
17、13.如12所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列为序列表中seq id no:3所示的核苷酸序列。
18、14.一种重组表达载体，包含以上8到13中任意一项所述的多核苷酸。
19、15.一种宿主细胞，其特征在于选自以下(a)和(b)构成的组：
20、(a)用以上8到13中任意一项所述的多核苷酸进行了转化的宿主细胞，以及
21、(b)用以上14所述的重组表达载体进行了转化的宿主细胞。
22、16.一种制备多功能催化酶的方法，其特征在于包括下列步骤：
23、将14所述的重组表达载体转化到大肠杆菌，优选大肠杆菌bl21(de3)中进行诱导表达，以获得可溶性蛋白；以及将所述可溶性蛋白纯化，从而获得所述多功能催化酶。
24、17.根据16所述的方法，其特征在于所述可溶性蛋白纯化包括利用镍柱亲和层析和凝胶阻滞层析纯化。
25、18.如以上1到7中任一项所述的多功能催化酶或者如以上8到13中任意一项所述的多核苷酸或者如以上15所述的重组表达载体在催化磷酸核糖转移、磷酸水解和核糖水解反应中任意一者中的应用。
26、19.如18所述的应用，其特征在于所述多功能催化酶为喹啉酸磷酸核糖转移酶，用于催化喹啉酸的磷酸核糖转移、磷酸水解和核糖水解反应，依次产生烟酸核糖单磷酸、烟酸核糖和烟酸。
27、20.一种制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于包括采用根据以上1到7中任一项所述的多功能催化酶以喹啉酸为底物催化合成烟酸核糖单磷酸本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多功能催化酶，其特征在于包含与序列表中SEQ ID NO:2具有75％以上同一性的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的多功能催化酶，其特征在于，所述氨基酸序列与序列表中SEQ IDNO:2具有80％以上，优选90％以上的同一性。
3.如权利要求1或2所述的多功能催化酶，其特征在于，所述氨基酸序列为序列表中SEQID NO:2所示的氨基酸序列。
4.一种多功能催化酶突变体，其特征在于，以序列表中SEQ ID NO:2为参考序列，该氨基酸序列具有位于第296位的定点突变。
5.如权利要求4所述的多功能催化酶突变体，其特征在于，序列表中SEQ ID NO.2中第296位的天冬氨酸被修饰为下列中的至少一种氨基酸：谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸以及赖氨酸，优选谷氨酸。
6.如权利要求4到5中任意一项所述的多功能催化酶突变体，其特征在于，所述氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。<...
【技术特征摘要】
1.一种多功能催化酶，其特征在于包含与序列表中seq id no:2具有75％以上同一性的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的多功能催化酶，其特征在于，所述氨基酸序列与序列表中seq idno:2具有80％以上，优选90％以上的同一性。
3.如权利要求1或2所述的多功能催化酶，其特征在于，所述氨基酸序列为序列表中seqid no:2所示的氨基酸序列。
4.一种多功能催化酶突变体，其特征在于，以序列表中seq id no:2为参考序列，该氨基酸序列具有位于第296位的定点突变。
5.如权利要求4所述的多功能催化酶突变体，其特征在于，序列表中seq id no.2中第296位的天冬氨酸被修饰为下列中的至少一种氨基酸：谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸以及赖氨酸，优选谷氨酸。
6.如权利要求4到5中任意一项所述的多功能催化酶突变体，其特征在于，所述氨基酸序列为序列表中seq id no:4所示的氨基酸序列。
7.如权利要求1到3中任意一项所述的多功能催化酶，其特征在于，所述多功能催化酶衍生自吡啶霉素链霉菌(streptomyces pyridomyceticus)b-2517。
8.一种多核苷酸，其特征在于包含选自下列(i)和(ii)中任意一者的核苷酸序列：
9.如权利要求8所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列与序列表中seq id no:1具有8...
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