【技术实现步骤摘要】
整合目的基因片段的方法
本申请是申请号为201910951144.8、专利技术名称为“定点整合大片段外源DNA的方法”的中国专利申请的分案申请。
本申请涉及基因工程
具体地，涉及整合目的基因片段的方法，本申请的方法适合将目的基因片段，尤其是300kb以上大片段外源DNA高效地定点整合到细胞的基因组中。专利技术背景对细胞的基因组进行大规模DNA修饰，尤其是对基因组中定点整合超长基因片段，尤其长度在300kb以上的外源基因大片段一直是生物技术的难点问题。哺乳动物人工染色体(mammalian artificial chromosome，MAC)是从哺乳动物细胞中分离出的，并由复制起始区、端粒以及着丝粒构建而成的克隆载体。该载体可以用于装载大于1000kb的外源DNA片段。利用微细胞介导的染色体转移技术(microcell mediatedchromosome transfer，MMCT)可以将MAC所携带的大片段外源基因导入真核细胞(Martella,Pollard et al.2016)。由于MAC是游离于染色体存在的，因此外...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.整合目的基因片段的方法，其包括以下步骤：1)获得目的基因片段，所述目的基因片段的长度超过100kb，其中所述步骤1)中的目的基因片段是从BAC载体上获得的；2)将目的基因片段克隆到环状YAC载体中，在所获得的包含目的基因片段的载体中插入了截断型新霉素(G418)抗性表达盒1，所述表达盒1在5
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至3
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方向上包含突变型Loxp1即Loxp66序列、部分HPRT内含子和抗性基因a部分即新霉素抗性基因Neo基因3
’
端部分；3)将含有所述目的基因片段的载体转化到酵母细胞内；4)将所述酵母内含有目的基因片段的所述载体导入到受体细胞，其中所述受体细胞是真核细胞，其中所述受体细胞的基因组中已经定点导入了截断型新霉素(G418)抗性表达盒2，所述表达盒2在5
’
至3
’
方向上包含部分HPRT内含子、突变型Loxp 2即Loxp71序列、抗性基因b部分即Neo基因5
’
端部分、含有雌激素受体(estrogen receptor，ER)的配体结合区突变体(ERT2)与Cre重组酶的融合蛋白CreERT2，和IRES
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PuroR结构；5)通过加入Tamoxifen诱导CreERT2的重组酶活性，所述Cre重组酶介导所述目的基因片段定点整合到所述受体细胞的基因组中，同时所述表达盒1和表达盒2形成表达完整抗性基因新霉素的抗性表达盒；6)筛选基因组中定点整合了所述目的基因片段的所述受体细胞，其中所述步骤2)中的抗性表达盒1截断型新霉素(G418)抗性表达盒1中的所述突变型Loxp 1和/或所述步骤4)中的抗性表达盒2截断型新霉素(G418)抗性表达盒2中所述突变型Loxp 2用于将所述表达盒定点导入所述受体细胞的基因组中，其中在所述步骤2)中的抗性表达盒1中所包含的抗性基因a部分新霉素抗性基因Neo的3
’
端部分和所述步骤4)中的抗性表达盒2中的抗性基因b部分Neo基因5
’
端部分是功能互补的，其中所述步骤2)中的抗性表达盒1截断型新霉素(G418)抗性表达盒1中包含的HPRT内含子、抗性基因a部分Neo基因3
’
端部分和所述步骤4)中的抗性表达盒2截断型新霉素(G418)抗性表达盒2中包含的HPRT内含子、抗性基因b部分Neo基因5
’
端部分，以及步骤5)中形成的表达完整抗性基因的抗性表达盒新霉素Neo的新霉素(G418)抗性表达盒，用于筛选目的基因片段定点整合后的细胞重组子。2.根据权利要求1的方法，其中所述Neo基因5
’
端部分和所述Neo的3
’
端部分是在92位截断的，并且所述步骤6)通过加入特异性针对所述抗性基因的试剂抗生素G418来筛选基因组中定点整合了所述目的基因片段的所述受体细胞。3.根据权利要求2的方法，其中新霉素的第92位氨基酸是由所述Neo基因5
’
端部分的末尾核苷酸和Neo基因的3
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端部分的起始核苷酸共同编码的。4.根据权利要求2的...
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