对非人动物基因改造的方法及构建的免疫缺陷动物模型技术

本申请涉及对非人动物进行基因改造的方法及利用该方法构建若干免疫缺陷动物模型，具体来说本申请涉及一种对非人动物，进行基因改造的方法，其包括：对非人动物细胞的受精卵进行基因改造，基因改造包括利用CRISPR/Cas9对非人动物的受精卵进行基因编辑。非人动物的受精卵进行基因编辑。

【技术实现步骤摘要】
对非人动物基因改造的方法及构建的免疫缺陷动物模型


[0001]本申请涉及一种对非人动物进行基因改造的方法及利用该方法构建若干免疫缺陷动物模型。

技术介绍

[0002]小鼠免疫系统人源化通常是指在免疫缺陷型小鼠体内植入人外周血白细胞(hPBMC)或人造血干细胞(CD34+HSC)以后，在小鼠体内重建一种或几种人免疫细胞。一方面，小鼠免疫系统人源化过程可以用于检测人类造血干细胞及基于人类造血干细胞的治疗细胞的分化和定植功能，另一方面人源化的小鼠还能够更好地模拟人类免疫系统及肿瘤免疫微环境，在传染性疾病、抗体药物开发，自身免疫病以及肿瘤学研究等多领域的有不可替代的作用。
[0003]免疫系统人源化通常需要使用重度免疫缺陷小鼠。在重度免疫缺陷小鼠表达某些人源化的细胞因子，有助于在小鼠重建完善的人免疫系统。重度免疫缺陷小鼠通常是指NOD scid IL2RγKO小鼠(SCID突变及IL2Rγ敲除的NOD小鼠)，BALB/c Rag1KO.IL2RγKO(IL2Rγ及Rag1敲除的BALB/c小鼠)或BALB/c Rag2KO.IL2RγKO小鼠(IL2Rγ及Rag2敲除的BALB/c小鼠。相较于仅有SCID、Rag1或Rag2敲除的普通的免疫缺陷小鼠，重度免疫缺陷小鼠进一步敲除了IL2Rγ，不仅缺少T细胞，B细胞，而且缺少NK细胞功能，并且巨噬细胞、树突状细胞的数量也大量减少，进一步降低了免疫功能的小鼠，更加有利于人源化免疫系统的构建。
[0004]二十年前，日本的实验动物中央研究所(CLEA)发展了以NOD为遗传背景的重度免疫缺陷型小鼠(NOD scid IL2RγKO，)。随后，美国的Jackson Lab也开发了类似的小鼠，命名为很多中国公司也开发了以NOD为背景的重度免疫缺陷型小鼠，分别命名为NPG，NCG，NSI，B
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NDG，M
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NSG等。除了以NOD为遗传背景的重度免疫缺陷小鼠，还有以BALB/c为遗传背景的BALB/c Rag1/2KO IL2RγKO小鼠。目前，广泛用于重建人免疫系统的重度免疫缺陷小鼠是NOD scid IL2RγKO小鼠，而BALB/c Rag1/2KO IL2RγKO小鼠天然免疫活性比NOD scid IL2RγKO小鼠要高，重建人免疫系统能力也比NOD scid IL2RγKO小鼠要弱，如果要提高BALB/c Rag1or2KO IL2RγKO小鼠重建人免疫系统的程度，需要经过更多的基因修饰。因此，BALB/c Rag1or2KO IL2RγKO小鼠在应用上不如NOD scid IL2RγKO小鼠广泛。以上所述重度免疫缺陷小鼠被统称为第一代重度免疫缺陷小鼠。
[0005]在重度免疫缺陷型小鼠体内重建人源化免疫系统通常是通过向小鼠体内植入人的造血干细胞(CD34+HSC)来实现的。一段时间后，人造血干细胞可在小鼠体内重建出各种免疫细胞，例如人T细胞、人B细胞、人髓系细胞等。人的免疫系统通常需要人细胞因子的支持才能分化成熟。但由于第一代重度免疫缺陷小鼠缺少人MHC分子，而且部分小鼠细胞因子和人细胞因子缺少交叉反应，因此在一代重度免疫缺陷小鼠体内重建的人免疫系统存在功能缺陷，例如髓系细胞比较少，淋巴组织发育不全，T细胞和B细胞功能不完善。
[0006]因此，不断有人尝试在重症免疫缺陷小鼠体内表达人细胞因子或可发挥与人细胞因子同等作用的工程化细胞因子。然而目前广泛用于重建人免疫系统的NOD scid IL2Rγ
KO小鼠由于遗传背景的特性，其胚胎干细胞(ES细胞)不适于进行基因改造。而且这种小鼠的受精卵受孕率低，细胞核发育不成熟，也很难直接用于制作基因敲入或者过表达的转基因小鼠。由于对这种小鼠进行基因修饰的难度大，因此制作转基因重度免疫缺陷小鼠的方法通常是先对C57BL小鼠进行基因修饰，然后和NOD scid IL2RγKO小鼠连续回交10代。经过约两年后，C57BL遗传背景的转基因小鼠可转变为NOD scid IL2RγKO遗传背景的转基因小鼠。
[0007]例如，近几年来，CLEA和Jackson Lab也开发了以NOD scid IL2RγKO为遗传背景的转基因小鼠，如NSG
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Tg(hu
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IL
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15)、NSG
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SGM3、hIL2 NOG、hIL
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6NOG、hIL
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15NOG、NOG
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EXL等，以获得更加适宜于重建人造血干细胞系统的小鼠。日本的实验动物中央研究所(CLEA)开发的hIL
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15NOG，利用CMV启动子在NOG小鼠过表达了人的IL
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15，血浆表达量达到80
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120pg/ml。但是因为细胞因子表达量略高，亦或细胞因子非特异性表达导致的细胞毒性，小鼠在重建人免疫系统之后容易获得消耗性疾病(waiting disease)，减少实验的窗口期。不过试验证明在hIL
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15NOG小鼠中纯化的人外周NK细胞可以长时间维持生长。为了使人IL
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15达到生理性表达，美国Jackson Lab利用BAC转基因技术，将完整人IL5基因座转入NSG小鼠获得NSG
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Tg(hu
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IL
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15)。人IL
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15在血浆表达量为7.1pg/ml。无论NSG
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Tg(hu
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IL
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15)小鼠或是hIL
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15NOG小鼠，都是利用转基因技术在小鼠表达外源的人IL
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15，并不能替换NOG或NSG小鼠内源的IL
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15。因此内源的IL
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15也会对人免疫系统的功能，特别是人NK细胞的功能产生干扰。另外，由于遗传背景的特异性，利用同源重组原理对NOD scid IL2RγKO小鼠的受精卵或ES细胞直接进行基因编辑的技术难度高，也没有成功报道。因此这些小鼠都是以经典的受精卵显微注射方式建立C57BL为遗传背景的转基因小鼠，然后和NOD scid IL2RγKO小鼠连续回交10代以上，得到过表达人细胞因子的重度免疫缺陷小鼠。整个回交过程历时约2年。
[0008]综上所述，现有技术中对NOD scid IL2RγKO小鼠直接进行基因改造的成功率低，难度大，因此需要利用其它遗传背景的小鼠进行多代回交，导致消耗大量的时间和人力成本。并且现有技术中小鼠体内的人源细胞因子过表达，或与小鼠自身细胞因子的互相干扰，对小鼠本身发育成长和寿命产生不良影响，同时也会影响到在小鼠体内构建的人免疫系统的功能。对于与维持小鼠自身健康相关且与人同源细胞因子缺乏交叉活性的细胞因子，在小鼠体内进行人源化替代小鼠原有细胞因子或是使用现有技术进行过表达均会影响小鼠的健康和寿命，以及在其体内构建人免疫系统的功能。

技术实现思路

[0009]技术问题...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种对非人动物，进行基因改造的方法，其包括：对非人动物细胞的受精卵进行基因改造，基因改造包括利用CRISPR/Cas9对非人动物的受精卵进行基因编辑；优选地，所述受精卵是体外受精的受精卵；进一步优选地，所述受精卵是通过体外受精得到的，并且在体外培养一定时间的受精卵，优选一定时间为6小时以上，进一步优选为8小时以上、10小时以上、12小时以上、14小时以上，最优选16小时以上。2.根据权利要求1所述的方法，其中，对非人动物细胞的受精卵进行基因改造是通过对受精卵的细胞核或细胞质进行注射来完成的；优选地，利用CRISPR/Cas9方法，需要注射用于同源重组的线性DNA模板大于等于2.5kb，对非人动物的受精卵进行基因编辑是对非人动物细胞的受精卵的细胞核进行显微注射；优选地，所述非人动物是以NOD为遗传背景的小鼠，所述小鼠优选是敲除了重组激活基因1(Rag1)或敲除了重组激活基因2(Rag2)或SCID突变的、缺失了T细胞和B细胞的免疫缺陷NOD小鼠，所述小鼠再进一步优选是进一步敲除了IL2受体γ链的缺失了NK细胞的重度免疫缺陷NOD小鼠。3.一种对非人动物进行基因改造的方法，其包括：通过对非人动物的受精卵进行基因改造使得细胞因子基因或免疫相关基因在原位进行人源化，而在这些细胞因子基因或免疫相关基因人源化后免疫缺陷型小鼠的健康和繁殖效率不会受到影响；所述细胞因子包括以下任意一种或两种以上：白细胞介素
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15(IL
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15)、白细胞介素
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7(IL
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7)、白细胞介素
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6(IL
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6)、B细胞活化因子(BAFF)、FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)重组蛋白；所述免疫相关基因包括主要组织相容性复合体(MHC)；优选地，所述细胞因子为白细胞介素
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15(IL
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15)。4.根据权利要求3所述的方法，其中，对非人动物进行基因改造的方法是对非人动物的受精卵进行基因改造，优选利用CRISPR/Cas9对非人动物的受精卵进行基因编辑，进一步优选，对受精卵的细胞核进行显微注射从而利用CRISPR/Cas9对非人动物的受精卵进行基因编辑以实现对细胞因子进行原位人源化；优选地，对非人动物的受精卵进行基因改造是在所述非人动物的IL
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15第四个外显子的后面插入兼并的人IL
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15第五到第八个外显子的编码序列；优选地，对非人动物的受精卵进行基因改造还包括在所述非人动物的IL
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15第四个外显子后面进一步插入bGHpolyA(bovine growth hormone polyadenylation)序列；优选地，所述bGHpolyA序列如SEQ ID No.2所示；优选地，在所述非人动物的IL
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15第四个外显子后面插入兼并的人IL15第五到第八个外显子的编码序列如SEQ ID No.1所示。5.根据权利要求3或4所述的方法，其中，所述非人动物是以NOD为遗传背景的小鼠，
所述小鼠优选是敲除了重组激活基因1(Rag1)或敲除了重组激活基因2(Rag2)或SCID突变的、缺失了T细胞和B细胞的免疫缺陷NOD小鼠，所述小鼠再进一步优选是进一步敲除了IL2受体γ链的缺失了NK细胞的重度免疫缺陷NOD小鼠；优选地，所述小鼠的IL
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15第四个外显子的序列如SEQ ID No.4所示。6.根据权利要求4或5所述的方法，其中，所述非人动物的受精卵是通过体外受精获得的；优选地，对所述非人动物的受精卵进行基因改造之前对体外受精得到的受精卵在体外培养一定时间，优选一定时间为6小时以上，进一步优选为8小时以上、10小时以上、12小时以上、14小时以上，最优选16小时以上；优选地，所述对所述非人动物的受精卵进行基因改造是对受精卵的细胞核进行显...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄菁，卢娜，
申请(专利权)人：黄菁，
类型：发明
国别省市：