一种提高CHO细胞同源重组效率的方法及其相关产品和应用技术

本发明专利技术公开了一种提高CHO细胞同源重组效率的方法及其相关产品和应用，本发明专利技术首次在CHO细胞中发现并证明了单独敲除POLQ基因，抑制al

【技术实现步骤摘要】
一种提高CHO细胞同源重组效率的方法及其相关产品和应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体而言，本专利技术涉及一种提高同源重组效率的方法，更具体地，本专利技术涉及一种提高CHO细胞同源重组效率的方法及其相关产品和应用。

技术介绍

[0002]中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells，CHO)是工业生产重组蛋白类生物药物最主要的细胞株，自1957年Dr.Theodore T.Puck从成年雌性仓鼠卵巢分离获得第一株野生型CHO细胞以来，经过多次改造逐渐形成以DHFR
‑
CHO(缺失二氢叶酸还原酶)表达系统和GS
‑
CHO(缺失谷氨酰胺合成酶)表达系统为主的商业化表达系统。目前，CHO细胞已经是用于包括基因工程抗体类药物在内的重组糖蛋白药物生产的首选宿主细胞，主要有以下原因：1、CHO细胞能够较好地适应悬浮培养，在生物反应器中可获得较高的密度，有利于工业上大规模培养；2、CHO细胞能够在翻译后进行修饰，尤其是在蛋白糖基化方面，与人类基本一致；3、利于外源基因整合，具有外源重组基因的高效扩增和表达能力；4、CHO细胞属于成纤维细胞，是一种非分泌型细胞，很少分泌自身的内源蛋白，因此十分有利于下游目标蛋白的分离纯化；5、CHO细胞能够在无血清和化学成分明确的培养基中培养，能够确保不同批次培养的重复性；6、CHO细胞不易传播人类感染病毒。目前，构建工业化稳转重组细胞株的方法主要是通过随机转基因技术或者有专利保护的商业化的位点特异重组酶为基础的FLIP
‑
IN技术进行制备，存在外源基因重组效率不高以及筛选高表达工程细胞株耗时耗力等方面的问题。
[0003]以同源重组为基础的基因打靶技术(Gene targeting)的出现，能定点的敲入外源基因(Gene insertion)，解除转基因技术随机插入的问题，同时结合ROSA26、H11、HPRT、c12orf35等安全位点技术，可以将外源基因定向的整合到安全位点，这样可以保证外源基因持续稳定的高表达。然而传统的基因打靶效率很低、目的基因大概率进行随机整合而非定点敲入，而且通常在小鼠的胚胎干细胞(ES细胞)中完成。在大型哺乳动物原代及其他类型细胞的基因打靶效率更低，大大限制了其应用。直到第一代锌指核酸酶(Zinc
‑
finger nucleaaes，ZFNs)基因编辑技术，以及随后的第二代转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator
‑
like effector nucleases，TALENs)、第三代规律成簇间隔短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)/Cas9技术的出现，才提高了此技术的效率及应用面。2010年Orlando SJ等研究人员首次利用ZFNs技术以寡核苷酸(Oligonucleotide)或者短的供体载体为模板在CHO细胞的内源GS基因进行非同源重组依赖的基因敲入。随后Cristea于2013年首次利用ZFNs和TALENs技术结合体内双切供体载体，完成CHO细胞上的非同源臂依赖的基因敲入。虽然目的基因可以整合到目的基因区域，但并不是精确的同源重组，因为即使有基因编辑技术，CHO细胞自身同源重组效率依然很低。2017年Kawabe Y研究团队利用CRISPR/Cas9和MMEJ的PITCh技术成功对CHO细胞进行基因敲入，同样也是非同源重组依赖的。2016年Jae Seong Lee团队首次利用CRISPR/Cas9、同源重组技术及荧光报告系统富集技术在CHO细胞中完成了目的基因的定
点敲入。虽然少数研究证明CHO细胞可以实现目的基因精确的定点敲入，但总体的同源重组效率远远低于目的基因随机整合效率。因此，提高CHO细胞同源重组效率成为了目前本领域亟待解决的技术问题。
[0004]传统的转基因技术具有外源基因随机的，多拷贝插入等缺陷，这样通常造成位置效应和基因沉默，使外源基因不能持续稳定的表达。同时由于多拷贝的插入，很难确定外源基因具体的插入位置，也容易造成受体细胞基因组的插入突变，对受体细胞本身造成潜在危害。这些都大大限制了转基因技术制备CHO细胞生物反应器的发展和应用。随后国外公司利用逆转录病毒随机筛选法，获得了可以高效支持外源基因表达的位点，并且建立FLIP
‑
IN技术制备了商业化细胞系，通过位点重组酶系统进行外源基因的定点敲入，但此技术的位点属于商业机密，未对外公开，相关定点CHO表达系统只能通过商业化购买，价格昂贵，且操作繁琐，具有很强的技术壁垒，大大限制CHO细胞生物反应器的通用性和实用性。因此解决上述技术缺陷对于构建CHO宿主细胞而言十分重要。
[0005]最近，相关研究学者通过实验研究证明了在小鼠胚胎干细胞及人B淋巴细胞白血病细胞(Nalm6细胞)中对LIG4基因和POLQ基因同时进行敲除，从而抑制宿主细胞的NHEJ修复途径进而抑制随机整合，提高细胞的同源整合效率，但是在该研究中单独敲除POLQ基因，并没有明显提高同源重组效率。以往诸多研究表明CHO细胞是一个同源重组效率很低的细胞系，目前在该细胞中导入外源基因表达都是通过随机整合和重组酶介导的位点特异重组技术来介导。本专利技术首次在CHO细胞中证明单独敲除POLQ基因，抑制al
‑
NHEJ修复途径可以高效提高CHO细胞同源重组效率，对于其在细胞生物反应器中意义重大。本专利技术首次利用CRISPR/Cas9技术成功制备了POLQ基因敲除的CHO
‑
K1工具细胞系，并验证此工具细胞系发生同源重组的效率远高于野生型的CHO
‑
K1细胞系。此技术为CHO细胞高效的精确整合目的基因及高效表达外源目的蛋白提供了有效的途径。

技术实现思路

[0006]为了解决当前本领域现有技术存在的上述技术缺陷，本专利技术的目的在于提供一种提高CHO细胞同源重组效率的方法及其相关产品和应用。
[0007]本专利技术的上述目的通过以下技术方案得以实现：
[0008]本专利技术的第一方面提供了一种提高CHO细胞同源重组效率的方法。
[0009]进一步，所述方法包括敲除CHO细胞中的POLQ基因和/或抑制CHO细胞中POLQ基因的表达。
[0010]进一步，所述CHO细胞为中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells，CHO)，是工业生产重组蛋白类生物药物最主要的细胞株，CHO细胞目前已经成为用于包括基因工程抗体类药物在内的重组糖蛋白药物生产的首选宿主细胞；
[0011]优选地，所述CHO细胞为CHO
‑
K1细胞。
[0012]进一步，所述方法包括如下步骤：
[0013]步骤(1)：利用基因编辑技术将CHO细胞中的POLQ基因敲除和/或失活；
[0014]步骤(2)：细胞分选，对经细胞分选得到的POLQ基因敲本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高CHO细胞同源重组效率的方法，其特征在于，所述方法包括敲除CHO细胞中的POLQ基因和/或抑制CHO细胞中POLQ基因的表达。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤(1)：利用基因编辑技术将CHO细胞中的POLQ基因敲除和/或失活；步骤(2)：细胞分选，对经细胞分选得到的POLQ基因敲除和/或失活的CHO细胞进行鉴定和筛选；优选地，步骤(1)中所述基因编辑技术包括CRISPR/Cas9、Cas12a、SpRY
‑
Cas9、SpG
‑
Cas9及相关突变体、ZFNs、TALENs；更优选地，步骤(1)中所述基因编辑技术为CRISPR/Cas9；最优选地，步骤(1)中所述利用基因编辑技术将CHO细胞中的POLQ基因敲除和/或失活为利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将CHO细胞中的POLQ基因敲除。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将CHO细胞中的POLQ基因敲除包括如下步骤：步骤(a)：针对仓鼠POLQ基因设计靶向POLQ基因的sgRNA的靶向识别区域；步骤(b)：将步骤(a)得到的成对的sgRNA退火、配对，获得带有粘性末端的双链DNA片段；步骤(c)：将步骤(b)得到的双链DNA片段与酶切后的Cas9载体连接，获得重组表达载体；步骤(d)：将步骤(c)得到的重组表达载体转染CHO细胞，培养，获得POLQ基因敲除的CHO细胞；优选地，步骤(a)中所述的sgRNA的靶向识别区域的序列如SEQ ID NO:2所示；优选地，步骤(b)中所述的退火的条件为100℃、5min；优选地，步骤(c)中所述的Cas9及相关突变体载体包括pX330载体、pX460载体、pX459载体、pX458载体、pX552载体、pX551载体、pX856载体、pX855载体、pX854载体、pX853载体、pX852载体、pX851载体、pX603载体、pX602载体、pX601载体、pX600载体、pX399载体、pX398载体、pX396载体、pX395载体、pX393载体、pX389载体、pX388载体、pX387载体、pX386载体、pX335载体、pX334载体、pX260载体、pX165载体；更优选地，步骤(c)中所述的Cas9载体为pX330载体；最优选地，步骤(c)中所述的酶切后的Cas9载体为BbsI限制性核酸内切酶特异性切割后得到的特异线性质粒；优选地，步骤(d)中所述的转染的过程包括将步骤(c)得到的重组表达载体与绿色荧光蛋白表达质粒共转染CHO细胞；更优选地，所述绿色荧光蛋白表达质粒为pmax
‑
GFP。4.一种用于提高CHO细胞同源重组效率的靶向POLQ基因的sgRNA，其特征在于，所述s...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晶，孙照霖，王传杰，王明，乔春霞，罗龙龙，肖鹤，陈国江，李新颖，涂凯，刘金青，冯健男，沈倍奋，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：