扩张性心肌病伴心肾综合征动物模型的构建方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种扩张性心肌病伴心肾综合征动物模型的构建方法及应用。其通过动物Npr1基因特异性敲除的方式构建扩张性心肌病伴心肾综合征动物模型。利用CRISPR/Cas技术进行动物Npr1基因的特异性敲除，包括以下步骤：（a）靶序列测序：对动物的靶位点序列进行PCR扩增并测序验证；（b）根据Npr1基因靶序列设计一对相应的sgRNA序列；（c）将Cas9/sgRNA显微注射到动物的受精卵中，培育获得F0代动物，将阳性F0代动物与野生型动物交配获得具有稳定基因型的F1代动物，并检测其基因型。本发明专利技术基于Npr1

【技术实现步骤摘要】
扩张性心肌病伴心肾综合征动物模型的构建方法及应用


[0001]本专利技术涉及医学实验模型构建
，具体地说是一种扩张性心肌病伴心肾综合征动物模型的构建方法及应用。

技术介绍

[0002]扩张性心肌病(扩心病)已经严重威胁人类的安全和健康，其主要表现为心室腔变大和左室收缩功能减退。患者在早期症状不明显，直至出现呼吸困难、活动气促、双下肢水肿等心衰症状和体征，晚期可出现严重心律失常，如窦房阻滞、Ⅲ度房室传导阻滞、室颤，成为致死原因之一，对生命造成巨大威胁。随着心功能不全进行性加重，可出现肾功能不全进行性加重，引起心肾综合征。心衰和肾衰竭可相互影响，产生恶性循环，加重病情，成为目前扩心病治疗的一大难题。
[0003]近来病毒性、免疫性、酒精毒性、阿霉素毒性等扩心病伴心肾综合征模型偶见报道，但因稳定性差，未能完整反应扩心病发病机制、病理生理、血流动力学改变、神经内分泌激活等相关过程，缺乏模型的复制意义。故建立一种稳定、高效、符合扩心病的实验动物模型，有助于扩心病的相关实验研究，也是研究扩心病伴心肾综合征发生机制及治疗措施的关键。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的就是提供一种扩张性心肌病伴心肾综合征动物模型的构建方法及应用，以解决现有技术中扩心病伴心肾综合征模型稳定性差，未能完整反应扩心病发病机制、病理生理、血流动力学改变、神经内分泌激活等相关过程的问题。
[0005]本专利技术的目的是这样实现的：一种扩张性心肌病伴心肾综合征动物模型的构建方法，其通过动物Npr1基因特异性敲除的方式构建扩张性心肌病伴心肾综合征动物模型。
[0006]利用Cre
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LoxP技术、TALEN技术、ZFN技术或CRISPR/Cas技术进行动物Npr1基因的特异性敲除。
[0007]利用CRISPR/Cas技术进行动物Npr1基因的特异性敲除，包括以下步骤：
[0008](a)靶序列测序：对动物的靶位点序列进行PCR扩增并测序验证；
[0009](b)根据Npr1基因靶序列设计一对相应的sgRNA序列，其中，针对5'靶位点的sgRNA序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.8任一所示，针对3'靶位点的sgRNA序列如SEQ ID NO.9至SEQ ID NO.16任一所示；
[0010](c)将Cas9/sgRNA显微注射到动物的受精卵中，培育获得F0代动物，将阳性F0代动物与野生型动物交配获得具有稳定基因型的F1代动物，并检测其基因型，基因型为Npr1
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的动物即为扩张性心肌病伴心肾综合征动物模型。
[0011]利用CRISPR/Cas技术特异性敲除动物Npr1基因的1号外显子。
[0012]步骤(a)中，所述动物为C57BL/6N小鼠。
[0013]步骤(b)中，一对相应的sgRNA序列分别设计在ATG上游～2.6kb区域和exon1下游。
[0014]步骤(b)中，验证所设计的sgRNA的活性：根据sgRNA序列合成oligos，通过Gibson的方式连入pCS
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4G载体，连接产物转化后测序验证；然后采用CRISPR/Cas9活性检测方法检测对应的sgRNA的活性，筛选高活性的sgRNA。
[0015]一种上述方法构建的动物模型的评价方法，基于以下测定结果进行模型评价：PCR鉴定模型动物基因型；Western
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blot、免疫荧光和免疫组化检测NPR
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A蛋白表达量；观察模型动物体重；心电图观察模型动物心率；尾压法监测模型动物尾动脉血压；超声心动图观察模型动物心功能情况；生化检查模型动物钠、钾和肌酐排泄以及肌酐清除率来评估其肾功能。
[0016]上述方法构建的动物模型应用于研究扩张性心肌病伴心肾综合征发生发展的分子机制，或制备和/或筛选治疗扩张性心肌病伴心肾综合征的药物。
[0017]本专利技术的扩心病伴伴心肾综合征动物模型建立基于Npr1
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小鼠，该模型稳定、可遗传、成模率高。可应用于研究扩张性心肌病伴心肾综合征发生发展的分子机制，或制备和/或筛选治疗扩张性心肌病伴心肾综合征的药物。
附图说明
[0018]图1，打靶方案和8条sgRNA活性图。
[0019]图2，基因型鉴定结果和NPR
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A蛋白表达量分析。
[0020]图3，小鼠体重、心率和血压。
[0021]图4，小鼠超声心动图和心脏形态学染色。
[0022]图5，小鼠肾功能排泄指标变化。
具体实施方式
[0023]下面结合具体实施例对本专利技术的技术方案进行详细说明。本专利技术实施例中未提到的试验条件和操作均按本领域常规方法或制造商建议的条件进行。
[0024]实施例1
[0025]本专利技术的扩心病伴心肾综合征动物模型建立方法的具体步骤如下：
[0026](1)模型构建：分析Npr1基因结构，删除该基因的exon1(包含5
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UTR)。2个sgRNAs分别设计在ATG上游～2.6kb区域和exon1下游，大约造成4.0kb的基因组缺失，达到Npr1基因敲除的目的。采用百奥赛图公司基于CRISPR/Cas9开发的EGE系统制备模式小鼠。方案如图1
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A所示。
[0027](2)靶序列测序：不同品系，靶基因序列可能有所差异。为了保证所设计Cas9/sgRNA的效率，首先需要对C57BL/6N鼠尾靶位点序列进行PCR扩增并测序验证，以保证sgRNA识别序列与C57BL/6N鼠尾DNA序列完全一致。通过对C57BL/6N鼠尾DNA进行靶位点序列PCR及测序，结果证明：C57BL/6N鼠尾靶序列与Genebank和Ensembl所给序列完全一致。
[0028](3)Cas9/sgRNA的设计与构建：基于sgRNA的设计原则，5'靶位点和3'靶位点区域分别设计了8条sgRNA，根据sgRNA序列合成oligos，通过Gibson的方式连入pCS
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4G载体。sgRNA序列如表1所示。
[0029]表1：
[0030][0031]合成sgRNA oligo，用纯水溶解，至终浓度为100μM。两条互补oligo各取15μL混合，并放入沸水浴煮5min后水浴中自然降温至室温，约2小时。将precut pCS载体与annealed oligo按以下反应体系进行连接反应。
[0032]连接体系：
[0033][0034]室温连接30min后，取5μL转化至50μL感受态细菌中，培养板(氨苄青霉素)培养过夜，从中挑取2个克隆，接种于3mL培养液(氨苄青霉素)，摇床培养过夜。提取质粒，并测序验证。选用测序结果正确的质粒进行后面活性检测。
[0035](4)质粒活性检测：将上述合适质粒转染入密度为90％的HEK293T细胞中(96孔板)，并培养24h后裂解，吸取30μL裂解液本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种扩张性心肌病伴心肾综合征动物模型的构建方法，其特征是，通过动物Npr1基因特异性敲除的方式构建扩张性心肌病伴心肾综合征动物模型。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征是，利用Cre
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LoxP技术、TALEN技术、ZFN技术或CRISPR/Cas技术进行动物Npr1基因的特异性敲除。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征是，利用CRISPR/Cas技术进行动物Npr1基因的特异性敲除，包括以下步骤：（a）靶序列测序：对动物的靶位点序列进行PCR扩增并测序验证；（b）根据Npr1基因靶序列设计一对相应的sgRNA序列，其中，针对5'靶位点的sgRNA序列如SEQ ID NO .1至SEQ ID NO .8任一所示，针对3'靶位点的sgRNA序列如SEQ ID NO .9至SEQ ID NO .16任一所示；（c）将Cas9/sgRNA显微注射到动物的受精卵中，培育获得F0代动物，将阳性F0代动物与野生型动物交配获得具有稳定基因型的F1代动物，并检测其基因型，基因型为Npr1
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的动物即为扩张性心肌病伴心肾综合征动物模型。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征是，利用CRISPR/Cas技术特异性敲除动物Npr1基因的1号外显子。5.根据权利要求3所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄耀孟，李曈昕，刘睿思，刘超，
申请(专利权)人：河北医科大学第一医院，
类型：发明
国别省市：